Técnicas em Biologia

Molecular

Profa. Sally Lacerda

Por que estudar o DNA, o RNA,
as proteínas?
Diagnostico molecular
• Genética humana Enquetes familiais
• Microbiologia
• Medicina legal
Paleontologia molecular

Genética molecular
Predisposição genética
Ferramentas laboratoriais

Farmacogenética
Terapia gênica

Novos alvos terapêuticos

Expressão recombinante
para proteínas de
interesse terapêutico
 Plano da aula
• Extração e Purificação do DNA, RNA e proteínas
• Analise do DNA
– Eletroforese
– Hibridação (Southern blotting )
– Amplificação (PCR e Clonagem)
– Enzimas de Restrição (RFLPs)
– Sequenciamento
– Ferramenta laboratorial
• Analise do RNA
• Analise das proteínas
Como extrair o DNA, o RNA e as
proteínas de células ou tecidos?
 Extração e Purificação do DNA
Inúmeras técnicas que
permitem o isolamento de DNA

Importante é:
1. tornar o DNA ou RNA acessível e
compatível com os sistemas de
analise
2. concentrá-los para garantir maior
sensibilidade
3. eliminar as nucleases e outras
substâncias inibidoras
 Eventos da extração
• A ruptura das membranas celulares
• Lise da célula contendo o acido nucléico
• Desnaturação dos complexos nucleoproteicos para liberar os ácidos nucléicos
• Inativação das nucleases endógenas
• Eliminação de proteínas
• Purificação dos ácidos nucléicos
por precipitação
• Coleta do material:
– Vários tipos de materiais podem
ser coletados
• Saliva, cabelo, para a medicina
legal
• Fóssil
– O sangue é o mais comum
– A urina é rica em inibidores
• Conservação
– DNA é resistente
• Sangue pode viajar a temperatura ambiente
• Biopsias congeladas
• Peças fixadas em parafina
– RNA é muito frágil
• O meio-ambiente é repleto de RNAse
 Lise Celular

• algum detergente (SDS no caso da

extração que utiliza fenol)
• antioxidantes
• EDTA
• agente tamponante, para a solubilização de
membranas lipoproteicas e desnaturação
de proteínas enquanto o DNA é protegido
da ação de enzimas de degradação.

Esta suspensão é submetida a uma

temperatura entre 50 e 65°C durante 15 a
60 minutos para facilitar a solubilização e
homogeneização da suspensão.
 Extração propriamente dita

– A suspensão é submetida a uma extração com um

solvente orgânico, clorofórmio-alcool isoamílico.

– As fases orgânica e aquosa são separadas através de

centrifugação.

– Lipídios, proteínas e a maioria dos polissacarídeos

são retidos na fase orgânica inferior, enquanto que o
DNA, RNA e alguns polissacarídeos são retidos na
fase superior (aquosa).
 Precipitação do DNA

– um álcool (isopropanol ou etanol + acetato de sódio) são

adicionados à fase aquosa.

– O DNA na presença de sal e álcool forma um precipitado

freqüentemente visível que pode ser “pescado” ou
“peletizado” por centrifugação.
 Purificação do DNA
– o precipitado de DNA/RNA é ressuspenso em um
tampão Tris- EDTA contendo RNAse para degradar o
RNA, restando apenas o DNA genômico desejado.
Como analisar o DNA?
 Eletroforese em gel de agarose

• método simples e eficiente que permite separação,

identificação e purificação de moléculas de DNA.
 Eletroforese em gel de agarose

As moléculas são separadas através da migração de partículas no gel, com

a aplicação de uma diferença de potencial elétrico, onde as moléculas de
menor massa migram mais rápido.
 Eletroforese em gel de agarose
• O protocolo padrão de gel de agarose permite separar
fragmentos de DNA entre 0,1 a 25 kb.
• A eletroforese também pode ser utilizada para separar
proteínas e moléculas de RNA.
 Eletroforese em gel de agarose

• A agarose é um polissacarídeo
que forma uma rede e permite
regular a velocidade da migração
das moléculas durante a
separação.
 Eletroforese em gel de agarose

• A adição de corante fluorescente (brometo de etídio ou sybr®),

se intercala entre as bases do DNA, e o uso de radiação
ultravioleta permitem a visualização e a fotografia
Leitura da eletroforese
Eletroforese em gel de agarose
Métodos para estudar o DNA e
detectar suas variações gênicas
 PCR

Polimerase Chain Reaction

 PCR
• possibilita a amplificação in vitro
de fragmentos de DNA
específicos

• parte de uma quantidade mínima

de DNA alvo ou de RNA
previamente convertido em cDNA.
 Componentes da PCR
• 1. a construção de dois oligonucleotídeos
(primers) específicos - de fita simples e
complementares as duas fitas molde de DNA -
desenhados de modo a flanquear a seqüência a
ser amplificada.
PCR – desenho dos primers
 Componentes da PCR
2. DNA polimerase. Geralmente derivada da bactéria
Thermus aquaticus, faz o processo vital de replicação
do DNA (extensão do primer)

bactéria encontrada em altas temperaturas em geisers no Yellow Stone National Park.

 Componentes da PCR
3. Um grande numero de bases do DNA livres (dNTPs)

4. DNA genômico a ser pesquisado (peq. quantidade)

Mg2+
DNA
Polimerase

dNTP

Primers
 PCR
• A técnica consiste de ciclos repetitivos:
– 1º passo (94-96ºC) - Desnaturação do DNA a alta
temperatura (rompimento das pontes de hidrogênio
que unem as duas fitas).
– 2º passo (30-60ºC) - Anelamento ou hibridização dos
primers em posições específicas (essa temperatura é
definida em função da seqüência nucleotídica dos
primers).
– 3º passo (72-75ºC) - Extensão da seqüência a ser
amplificada pela ação da DNA polimerase.
E o ciclo se repete 20-30 vezes
 PCR
• Vantagem
– Pode ser utilizada com quantidades extremamente
pequena de DNA
– Não requer clonagem gênica (+ rápida)
– Não utiliza sondas radioativas

• Desvantagem
– necessidade do conhecimento prévio das seqüência
de nucleotídeos que flanqueiam a seqüência de DNA
de interesse.
– Devido a extrema sensibilidade, corre risco de
contaminação
Técnica de PCR
 CICLOS DA PCR
PCR
Programa

94 0C por 5 min

94 0C por 1 min
55 0C por 1 min 35 ciclos
72 0C por 1 min

72 0C por 5 min
4 0C
 Desnaturação
• Processo no qual ocorre a separação da fita dupla
de DNA por meio da elevação da temperatura.

• As amostras são aquecidas a 94-96 ºC durante

um a vários minutos.
 Hibridação
• A temperatura é reduzida a 55-65 ºC durante
alguns segundos.

• Os iniciadores hibridam com as sequências

complementares do DNA molde
 Extensão
• Eleva-se a temperatura a 72ºC por alguns
segundos.

 A DNA polimerase faz a duplicação da cadeia a

partir dos iniciadores
Lendo a PCR
Estudo da leishimaniose por PCR

Roselino 2008
 Aplicações do PCR

Os produtos amplificados por PCR podem ter as seguintes

utilidades/ aplicações:

1. Detecção de deleções / inserções determinadas pela

geração de produtos amplificados que apresentam
alterações em seu tamanho.

2. Detecção de mutacões pontuais (substituição de

bases), conhecidas ou não, que geram polimorfismos
genéticos podem ser determinadas pela ação das
enzimas de restrição ou através do seqüenciamento.
 Aplicações do PCR
3. No diagnóstico pré-natal ou pré-implantacional (particularmente
para doenças herdadas).
4. Na tipagem para transplantes de órgãos e susceptibilidade para
doenças auto-imunes específicas (detecção de polimorfismo para HLA).
5. No diagnóstico e prognóstico de doenças de ordem genética,
como o câncer, através do estudo dos genes relacionados a essas
doenças.
6. Na medicina forense (DNA fingerprint).
7. No diagnóstico de doenças infecciosas por agentes
patogênicos diversos
 APLICAÇÕES DA TÉCNICA DE PCR

TESTE DE PATERNIDADE

Gel de Poliacrilamida corado com Nitrato de Prata

Trio Normal (sup. Pai, mãe e criança) ............................. R$ 600,00

Visualização do Gel em Paternidade Comprovada para um "locus" estudado

 PCR em tempo real
• medida de produtos gerados durante cada ciclo da PCR
em tempo real
• emissão dos compostos fluorescentes gera um sinal que
aumentará na proporção direta da quantidade de produto
da PCR.
• permite a quantificação, o acompanhamento da reação e
a apresentação dos resultados de forma mais precisa e
rápida,
• não mais requer a detecção em gel de eletroforese.
PCR em tempo real
 PCR em tempo real
• SYBR Green
• é um fluoróforo em suspensão, intercalante de DNA
dupla fita, que emite uma fluorescência verde com a
excitação da luz emitida pelo sistema ótico do
termociclador.

• Durante a PCR, as moléculas do SYBR Green vão se

ligando ao DNA recém sintetizado

• Um aumento da fluorescência é observado em tempo

real, o que possibilita o monitoramento contínuo da
reação
 PCR em tempo real

SYBR Green
PCR em tempo real
 PCR em tempo real
Aplicações
• Quantificação
• Detecção de carga viral
• Determinação do número de cópias de um
gene
• Análise da expressão gênica
PCR e PCR in real time
Clonagem Molecular
 Clonagem
Gênica

• Introduzir o gene em bactérias e

isolá-las em colônias.
• Consiste na propagação de
moléculas de DNA idênticas
• As células de cada colônia são
idênticas entre si (NASCIMENTO et al., 1999).
 Clonagem gênica
• consiste em duas etapas básicas:

1°) ligação entre um fragmento de DNA (inserto) contendo

o gene de interesse com uma outra molécula de DNA (o
vetor) para formar uma quimera ou molécula de DNA
recombinante (BROWN, 2003).
 Clonagem gênica
• 2°) O DNA recombinante é transportado para uma célula
hospedeira, em geral uma bactéria

• A célula que recebeu o DNA recombinante é chamada de

célula transformada,
• sofre muitos ciclos de divisão, produzindo várias cópias do
DNA recombinante
como produzir esses
DNArecombinantes?
 Vetores
• São moléculas de transporte de DNA
• Diversos tipos: plasmídeos, cosmídeos, fagos,
vírus, YACs, etc.
• Diferenças de tamanho de inserto
• Podem ter comportamento linear e/ou circular
 Vetores
• Todos contêm três características comuns:
– marca seletiva,
– origem de replicação (ori)
– sítio múltiplo de clonagem
(NASCIMENTO, 1999).
 Vetores
• A marca seletiva
– genes que conferem resistência a antibióticos
– proporcionam a seleção dos clones transformados daqueles não
transformados.
Vetores
 Vetores

• Origem de replicação

– permite ao DNA do plasmídeo replicar-se

independentemente do DNA cromossômico.

– Ori é uma seqüência específica de 50-100 pb

• presença obrigatória para a replicação do plasmídeo
 Vetores
• A replicação pode ser sincronizada com o
ciclo celular ou independente
 Vetores
• O sítio múltiplo de clonagem é um sítio de clivagem de endonucleases de
restrição
• onde é inserido o fragmento de DNA de interesse
• sem interferir na funcionalidade do plasmídeo (BROWN, 2003; WEAVER, 2001).
 Vetores
• Plamídeos
• Bacteriófagos lambda
• Cosmídeos
• YACs
 Plasmídeos

• Moléculas de DNA fita dupla extracromossomal encontrados

em bactérias.
• Variam em estrutura, tamanho, modo de replicação, número
de cópias por célula e habilidade para propagarem-se em
diferentes bactérias.
 Outros vetores
• FAGOS: Bacteriófagos lambda
– Vírus bacteriano com uma
molécula de DNA grande
(45kb)
– O lambda se replica na E.
coli e produz milhões de
vírus infecciosos
– Destruição celular e
liberação dos bacteriófagos
– 1/3 do genoma do
bacteriófago não é essencial
– Excelente para DNAr
(fragmentos de até 20kb)
Outros vetores
 Outros vetores
• YACs– 1987 (yeast artificial
chromosomes)
– Possível clonar grandes
fragmentos de DNA, até
1000kb
– Vetores que se replicam na
Saccharomyces
cerevisiase (levedura de
padaria)
– Possuem centrômeros e
telômeros “cromossomos
artificiais”
 Transformação celular
• A célula mais comumente utilizada é a Escherichia coli.
• O processo de transformação bacteriana ocorre in vitro
• Pode ser afetado pelo tamanho e conformação da molécula
de DNA a ser introduzida na célula
• Plasmídeos pequenos incorporam-se mais facilmente à
célula bacteriana competente.
 Transfecção celular
• Naturalmente, não há atração do DNA pelas células
bacterianas, devido à ocorrência da repulsão eletrostática
entre:
– as cargas negativas dos fosfolípideos da membrana e
– as cargas negativas dos grupamentos fosfatos da molécula de
DNA
 Técnica de transformação celular

• Dois diferentes métodos de transformação:

–Choque térmico

–Eletroporação
 Transformação celular
• Choque térmico

– Comumente chamado de transfecção com

Cloreto de Cálcio
– Método fácil e relativamente barato de transfecção.
– Tratamento das células com cloreto de cálcio (cloreto de lítio ou
magnésio) para torná-la competente.
– Os íons neutralizam as cargas negativas da membrana e do DNA.
– Após um choque térmico na temperatura de 37º a 42ºC, criam se poros
na membrana e o DNA pode alcançar o interior da célula
(MARANHÃO, 2003b;
NASCIMENTO et al., 1999).
 Transformação celular

• Eletroporação
– As células são submetidas a alta
voltagem (choque elétrico)

– Ocorre desestabilização da
membrana externa e a formação de
poros,

– Possibilita a entrada do DNA para o

interior da célula.
 Aplicações do DNA recombinante
• Estudo da estrutura dos genes
• Melhoramento genético
• Criação de modelos animais
• Diagnostico clínico
• Terapia gênica
ENZIMAS e o DNA
 Enzimas para manipulação de DNA

• As enzimas podem ser agrupadas em

cinco classes:
– Nucleases
– Ligase
– Polimerases
– Modificadoras
– Topoisomerase
 Enzimas para manipulação de DNA

• Nucleases e ribonucleases
– clivam a ligação fosfodiéster do DNA e RNA
– podem ter atividade exonucleásica 3' - 5' e/ou 5' -
3‘ ou endonucleásica.
 Enzimas para manipulação de DNA

• Endonucleases
– 1970, fundamental no desenvolvimento da clonagem
molecular, tecnologia do DNA recombinante.

– comumente chamadas de enzimas de restrição,

– clivam seqüências de DNA específicas em ambas as

fitas, chamadas de sítios de restrição, e podem gerar
extremidades abruptas ou coesivas
 Enzimas para manipulação de DNA

• Sitio de restrição
– Local de clivagem do DNA
– Ex. sitio de restrição da E coli

Cada vez que essa

seqüência é
encontrada, ela é
clivada entre o G e
A, gerando
fragmentos de
restrição
Anemia falciforme
 Anemia falciforme
• Enzima de restrição cliva CCTNAGG
• Dois fragmentos 1.100pb e 200pb
• Se houver a mutação = fragmento de
1300pb
Outras enzimas de restrição
 Enzimas para manipulação de DNA

• Ligases - catalisam a formação de uma ligação

fosfodiéster entre grupos 3'- OH e 5'-PO4-, unindo
covalentemente moléculas de DNA de fita dupla,
resultando em uma molécula de DNA recombinante.
 Enzimas para manipulação de DNA

• Polimerases - catalisam a síntese de moléculas de DNA

a partir de um molde, ou seja, sintetizam uma nova fita
de DNA, complementar a um molde de DNA ou RNA
preexistente.
Análise por Blotting
 Analise do DNA e RNA em blotting
• Baseada nas propriedades de hibridização das
moléculas de ácidos nucléicos.

• Foram propostas para localizar a posição de um

gene em uma molécula de DNA.

• Análise de DNA: Southern blotting.

• Análise de RNA: Northern blotting.
• Análise de proteinas: Westhern blotting.
Southern blotting
 Analise do DNA em blotting
• Primeiramente, o DNA é digerido com uma ou
mais enzimas de restrição e separado em uma
eletroforese em gel de agarose.
 Analise do DNA e RNA em blotting
• Os fragmentos de DNA fita dupla são desnaturados in
situ e transferidos para uma membrana de nylon ou
nitrocelulose, na qual são imobilizados no mesmo padrão
de bandeamento do gel.
• A membrana é colocada sobre o gel e um tampão de alta
concentração salina é adicionado

• Por capilaridade, passa através do gel, promovendo a

transferência dos fragmentos de DNA para a membrana.

• IMOBILIZAÇÃO ou FIXAÇÃO
– radiação UV, para as membranas de nylon,
– calor, para as membranas de nitrocelulose.

• A membrana resultante é uma réplica do gel de agarose

 Sonda de DNA
• Para pesquisar fragmentos específicos
 Analise do DNA e RNA em blotting
• Sondas de RNA ou DNA marcadas com radioatividade
são utilizadas,
• a hibridização com o DNA fixo na membrana ocorre
• uma auto-radiografia revela qual fragmento de restrição
contém o gene clonado
 Analise do DNA e RNA em blotting
• Para a análise de RNA, a técnica, recebeu o nome de
Northern blotting.
• Um RNA extraído é submetido à eletroforese em gel de
agarose,
• Transferido para uma membrana e hibridizado com
sondas radioativas de RNA ou DNA.
• Esta técnica permite identificar em qual tecido ou tipo
celular um determinado gene é expresso.
 O que são sondas e
para que servem?
• São moléculas de ácidos nucléicos clonadas (DNAr) ou
sintéticas, marcadas com radioisotopos.
• Usadas em reações de hibridização DNA-DNA ou DNA-
RNA
• Ex. usar uma sonda para o gene da distrofina ligado ao X
para investigar uma amostra de RNA muscular obtida de
um paciente com distrofia muscular de Duchenne
Sequenciamento do DNA
 Sequenciamento do DNA
• A sequência do DNA é um pré-requisito para a análise
detalhada de um gene.

• Pode indicar:
– sobre a natureza de uma mutação especifica
– O funcionamento de um gene
– O grau de similaridade de um gene com outros
desconhecidos
– Identificar a filogenia de uma espécie
 Seqüenciamento do DNA
• O método mais utilizado é o didesoxi, baseado no
método de Sanger-Coulson,
• Também conhecido como método de terminação de
cadeia,
• Usa-se didesoxiribonucleotideos finalizadores de cadeia

1. Não apresentam o grupo OH

2. Impede as ligações fosfodiéster
com as bases livres de DNA
vídeo
Adição dos ddNTPs
SEQUENCIAMENTO MANUAL
Auto-radiogramas de um gel de
seqüenciamento de DNA
Método de Sanger
automatizado
 Sanger sequencing
anelamento dos primers

desnaturação
SEQUENCIADOR
 Seqüenciamento do DNA
• os nucleotídeos são marcados com quatro
fluorocromos diferentes (A, C, G, T).
Tipos de analise