Biotecnologia

e Prod. Alimentos
Bruno M. Siqueira
Nutricionista - CRN9:13734
Métodos de purificação de ácidos nucleicos
• A extração e purificação dos ácidos nucleicos são as
primeiras etapas a serem realizadas independentemente
do que se deseja analisar.

• Existem kits comerciais que contêm os reagentes

empregados nesses procedimentos.
Métodos de purificação de ácidos nucleicos
• A escolha de um kit deve levar em consideração:

1) A origem da amostra, de onde foi extraída e a quantidade

disponível;
2) O método de preparação das amostras;
3) A intenção de uso do DNA;
4) O conteúdo húmico que são os produtos da decomposição
microbiana de matéria orgânica;
5) A simplicidade do protocolo e habilidade de automatizar a
extração.
Métodos de purificação de ácidos nucleicos
• A origem do material genético pode ser de amostras de
sangue, bulbo capilar, entre outros.

• Elas podem ter sido preparadas como pellets celulares

frescos ou congelados ou até células fixadas em etanol.
Métodos de purificação de ácidos nucleicos
• O objetivo da extração do DNA também deve ser levado
em consideração, pois a qualidade e pureza do material
são exigidas em diferentes graus entre uma análise de
PCR, sequenciamento e expressão gênica, por exemplo.

• Amostras que possivelmente apresentem conteúdo

húmico, como esterco e adubo, devem passar por um
processo de remoção dessas substâncias que podem
influenciar na pureza do material obtido.
Métodos de purificação de ácidos nucleicos
• A extração dos ácidos nucleicos é realizada em cinco
etapas.

1) Primeira delas compreende a lise celular por métodos

químicos ou físicos.

2) Em seguida, os lipídios são removidos com o uso de

detergentes e centrifugação;
Métodos de purificação de ácidos nucleicos
3) Logo após a remoção das proteínas do extrato celular é feita
a partir de desnaturação proteica, por ação de proteases, e
separação por centrifugação e/ou filtração.

4) A remoção do RNA é uma etapa opcional na maioria dos kits

e ocorre pela adição de enzima RNAse, que quebra a
molécula em subunidades ribonucleotídeas.

5) Por fim, os ácidos nucleicos de interesse são extraídos com

fenol, precipitados por ultracentrifugação ou métodos
cromatográficos (troca iônica, filtração em gel), agregados e
diluídos normalmente em etanol.
Métodos de purificação de ácidos nucleicos
• Essas metodologias que utilizam solventes orgânicos
como fenol e clorofórmio para a extração do DNA
apresentam desvantagens, como o fato de serem
compostos perigosos ao manuseio e o risco de
contaminação da amostra por resíduos dos próprios
solventes.
Métodos de purificação de ácidos nucleicos
• A extração em sílica, em que o DNA é adsorvido em
partículas de sílica formadoras de membranas e
superfícies, posteriormente transferido em solução
tampão com baixa concentração de sal.

• Essa metodologia permite aplicação em colunas e

microchips.
Métodos de purificação de ácidos nucleicos
• A separação magnética se torna possível pela ligação da
molécula de DNA a partículas ou grânulos magnéticos
revestidos com um anticorpo que permite a ligação.

• O processo pode ser automatizado, porém a

metodologia é mais cara quando comparada às demais.
Métodos de purificação de ácidos nucleicos
• Por fim, a tecnologia de troca iônica se baseia na
interação dos grupos fosfato carregados
negativamente com a superfície de um substrato
positivo;

• O material celular é separado por uma sequência de

lavagens com solução tampão com baixo teor de sal, e
o DNA, diluído em tampão com alto teor salino.
Separação eletroforética e hibridização de ácidos nucleicos
• A separação eletroforética é aplicada às moléculas de
DNA e/ou RNA já extraídas e separadas do conteúdo
celular, bem como permite a avaliação de cada uma
delas.
Separação eletroforética e hibridização de ácidos nucleicos
• Aa separação de moléculas carregadas, como os ácidos
nucleicos e proteínas, torna-se possível pela passagem
de um campo elétrico.

• Uma vez que as moléculas de DNA apresentam carga

negativa, deslocam-se em direção ao polo oposto;

• A amostra é colocada em uma estrutura de suporte,

imersa em solução tampão e disposta em uma cuba que
contém os eletrodos responsáveis pela passagem de
corrente elétrica.
Separação eletroforética e hibridização de ácidos nucleicos
• Vídeos:

• Separação eletroforética de DNA em gel de agarose:

https://www.youtube.com/watch?v=vL3EfRx78P0

• Separação eletroforética de DNA em gel de agarose:

https://www.youtube.com/watch?v=B2KLuzD_suQ
Separação eletroforética e hibridização de ácidos nucleicos
• Juntamente à separação eletroforética, pode ser
realizada a hibridização dos polímeros de nucleotídeos,
que consiste em utilizar uma fita simples da molécula de
DNA obtida por desnaturação e renaturação das
cadeias complementares, ou o RNA, como sonda
genética, para localizar um gene ou molécula em célula
ou tecido, assim como identificar aqueles expressos e
não expressos nas células, bem como
variantes/alterações genéticas.
Separação eletroforética e hibridização de ácidos nucleicos
• A fita única liga-se sequencialmente com sondas
marcadas por radioatividade, quimioluminescência ou
por um anticorpo, que contêm uma sequência inicial de
nucleotídeos específica a cada fragmento de DNA ou
RNA que se deseja avaliar. A molécula então passa por
hibridização, que consiste em ser adicionada de
nucleotídeos complementares à fita.
Separação eletroforética e hibridização de ácidos nucleicos
• Southern-blot: fragmentos de DNA, obtidos e separados por
eletroforese, são imobilizados em uma membrana de
nitrocelulose ou náilon;

• Uma sonda de DNA radioativa, contendo a sequência de

interesse, é hibridizada com o DNA imobilizado na
membrana que contém sequência complementar a ela;

• Em seguida, a membrana é lavada para a retirada das

sondas não hibridizadas e exposta a um filme radiográfico
para detectar a radioatividade, e só serão detectadas sondas
hibridizadas pela sequência específica do fragmento de
DNA que se deseja identificar.
Separação eletroforética e hibridização de ácidos nucleicos
• Video:

• Southern Blot:
https://www.youtube.com/watch?v=tQ69u_0GWKo&t=2
00s

• https://www.youtube.com/watch?v=YGoBZkpA2Tk&t=4s
Separação eletroforética e hibridização de ácidos nucleicos
• Northen Blotting e Western Blotting: apresentam o
mesmo princípio de hibridização aplicado à mRNA e
proteína, respectivamente, sendo utilizadas
principalmente nos estudos de expressão gênica e
identificação de proteínas.
Separação eletroforética e hibridização de ácidos nucleicos
Enzimas utilizadas na manipulação in vitro de ácidos nucleicos
• Enzimas denominadas endonucleases de restrição
permitiu aos cientistas a manipulação do DNA em
laboratório para obtenção de fragmentos de interesse.

• Essas enzimas existem naturalmente nos organismos e

atuam como proteção das células, clivando ou
quebrando DNAs invasores.
Enzimas utilizadas na manipulação in vitro de ácidos nucleicos
• Esse mecanismo é possível uma vez que as
endonucleases de restrição são sítio-específicas (capazes
de identificar determinada sequência de nucleotídeos e
agir sobre ela), sendo denominadas enzimas de restrição
tipo II.

• A propriedade de reconhecimento da sequência

nucleotídica independe da origem do DNA, e diferentes
endonucleases são produzidas por diferentes
microrganismos.
Enzimas utilizadas na manipulação in vitro de ácidos nucleicos
Enzimas utilizadas na manipulação in vitro de ácidos nucleicos
• Fragmentos de DNA formados pela ação de
endonucleases de restrição podem ligar-se novamente
entre si e/ou entre fragmentos de diferentes origens
(cromossomo, espécie), formando uma nova fita.

• Esse fato é importante porque a partir desse

conhecimento foi possível a manipulação do DNA em
laboratório – in vitro – e o desenvolvimento das
modernas técnicas de DNA recombinante que veremos
mais adiante.
Reação em cadeia da polimerase – PCR
• Para enxergarmos num gel de agarose quanto para
isolarmos uma determinada região do DNA,
precisaremos de muitas cópias dessas moléculas;

• A solução: é possível isolar genes e outros fragmentos de

DNA de interesse bem como amplificar a sequência até
conseguir milhões de cópias e facilitar a análise.
Reação em cadeia da polimerase – PCR
• Esse procedimento, denominado reação em cadeia da
polimerase, usualmente abreviado como PCR, é
realizado totalmente in vitro, em três etapas que
procuram simular a replicação do DNA nas células
vivas.
Reação em cadeia da polimerase – PCR
• Primeira etapa: o DNA genômico, que contém a sequência
de interesse a ser amplificada, é desnaturado por
aquecimento a uma temperatura entre 92 e 95°C por 15
segundos, permitindo a quebra das pontes de hidrogênio e
separação da fita dupla.

• Segunda etapa: o DNA desnaturado é anelado ou

hibridizado por incubação sob temperatura de 50 a 60°C
durante o tempo de 30 segundos e na presença de excesso
oligonucleotídeos sintéticos adicionados ao meio.

• Para isso, é necessário um par de iniciadores ou primers que

contenham uma sequência específica de nucleotídeos para o
gene que se deseja avaliar, sendo cada um deles
complementar às duas fitas de DNA.
Reação em cadeia da polimerase – PCR
• Terceira etapa: a DNA polimerase adiciona as bases
complementares, formando uma nova fita e duplicando
o DNA. Assim, uma dupla hélice produz duas duplas
hélices após um ciclo de replicação. Essa etapa de
polimerização é realizada a uma temperatura de 70 a
72°C por 1,5.

• O ciclo é reiniciado de 20 a 30 vezes, até se obter a

concentração de DNA desejada.
Reação em cadeia da polimerase – PCR
Reação em cadeia da polimerase – PCR
• Nos anos 2000, foi desenvolvida a técnica de PCR em
tempo real (qRT-PCR), que combina a metodologia da
PCR convencional com um mecanismo de detecção e
quantificação por fluorescência, permitindo que as três
etapas estudadas anteriormente sejam realizadas em
uma única, agilizando a obtenção dos resultados e
reduzindo o risco de erros e contaminação da amostra.
Reação em cadeia da polimerase – PCR
• A maior dificuldade no sequenciamento de genomas
está no fato de serem obtidas separadamente pequenas
sequências de DNA (de 400 a 500pares bases) chamados
contigs.

• Ainda não existem tecnologias capazes de ler genomas

inteiros.
Reação em cadeia da polimerase – PCR
• O fato de a molécula de DNA ter que ser fragmentada
para posteriormente ser sequenciada gera a necessidade
de montagem dos genomas, conhecida como assembly,
que utiliza técnicas avançadas de bioinformática.

• O espaço existente entre um contig e outro pode ser

obtido a partir da análise de hibridização de uma
biblioteca genômica de DNA clonada de um vetor.
Sequenciamento de DNA
• Métodos avançados:

❖Métodos de Sanger, metodologia enzimática utilizada no

Projeto do Genoma Humano;
❖O pirosequenciamento ou método de síntese, fundamentado
na detecção de raios luminosos emitidos de diferentes
pirofosfatos e liberados a partir da síntese de DNA;
❖SMRT (sequenciamento de DNA em tempo real), cujos
nucleotídeos são marcados por fluorescência
❖Sequenciamento de Nova Geração (NGS),

• São capazes de produzir 100 vezes mais dados que as

técnicas convencionais citadas anteriormente.
Sequenciamento de DNA
• Detecção das bases nitrogenadas adicionadas à fita
molde de DNA pelo sinal que emitem, luminescência ou
fluorescência, por exemplo, sendo registradas em picos
que as diferem entre si.
Sequenciamento de DNA
• Vídeos:

• Sequenciamento de Sanger:
https://www.youtube.com/watch?v=Uma54mKcR40

• Sequenciamento de DNA:
http://eaulas.usp.br/portal/video.action?idItem=1966
Trabalho! – Parcial 1
• Realizar uma pesquisa e descrever o processo passo a
passo de Western Blot e Northern blot.
Biotecnologia
e Prod. Alimentos
Bruno M. Siqueira
Nutricionista - CRN9:13734