Bazele teoretice ale biotehnologiilor microbiene

Biotehnologiile moderne constituie o achiziie de valoare fundamental i aplicativ a tiinei contemporane. Odat cu dezvoltarea cunotinelor de biologie celular, genetic molecular, biochimie, microbiologie i inginerie genetic a devenit posibil manipularea artificial a informaiei genetice a organismelor vii i pe aceast baz au aprut biotehnologiile moderne cu implicaii deosebite n ameliorarea plantelor, a animalelor, n producerea de substane biologic active (farmaceutice, produse chimice i bioenergetice valoroase). Biotehnologiile contemporane au implicaii deosebite n agricultur, industria alimentar, industria farmaceutic i chimic i medicin. n acest scop s!au elaborat programe prioritare pentru dezvoltarea i valorificarea practic a cercetrilor de inginerie genetic i biotehnologie. "entru pregtirea de specialiti n aceste domenii ale biotehnologiei au fost introduse n nvm#ntul superior cursuri de biotehnologii moderne. n accepia modern, biotehnologiile au aprut dup nceperea e$ploatrilor industriale i comerciale ale rezultatelor cercetrilor de biologie. "rimele generaii de biotehnologii se situeaz la nceputul secolului %&. n prezent, biotehnologiile moderne sunt ntr!o perioad de mare av#nt, descoperirile n acest domeniu se succed cu o vitez apreciabil. "e plan mondial se fac eforturi susinute pentru dezvoltarea cercetrilor privind manipularea artificial a informaiei genetice a plantelor, animalelor i microorganismelor pe care se bazeaz n mare msur biotehnologiile moderne. Organisme specializate au luat msuri at#t pentru aprofundarea cercetrilor din domeniul biotehnologiilor, dar mai ales pentru e$tinderea rezultatelor cercetrii n direcia aplicrii lor n agricultur, industria alimentar, chimic i farmaceutic. 'ecolul () a nsemnat un pas uria n dezvoltarea cercetrilor de genetic, inginerie genetic, biologie celular i molecular, de biochimie i microbiologie. *otodat s!au dezvoltat tehnicile de culturi de celule vegetale, animale i de microorganisme. '!au creat astfel premisele apariiei biotehnologiilor moderne i a bioindustriei. Biotehnologiile moderne i bioindustriile vor contribui la rezolvarea unor probleme ma+ore ale umanitii. 'e consider c de acestea trebuie s beneficieze rile n curs de dezvoltare care vor putea cu a+utorul acestor biotehnologii s!i amelioreze situaia sau starea alimentar i sanitar i s realizeze progrese n protecia mediului ncon+urtor. Bioindustriile au cunoscut o dezvoltare deosebit dup descoperirea n %&(, a penicilinei de ctre -leming i industrializarea ei n %&.&. O alt perioad de dezvoltare a bioindustriilor se poate situa dup %&,( c#nd apar tehnicile de inginerie genetic i p#n n %&,/ c#nd noile metode de producere a anticorpilor dau noi obiective bioindustriilor. % %

0ac p#n n %&,/ putem vorbi de 1biologie industrial2, 1industria de fermentaie2, 1farmacologie2, dup acest moment s!a simit nevoie de a gsi o nou definiie. 3nii autori neleg prin biotehnologii toate procedeele chimice, fizice sau informatice care servesc la transformarea industrial a viului. 4li autori se limiteaz la tehnicile ce decurg din tiinele vieii ca genetica, biochimia, biologia celular, imunologia. "entru aceti autori termenul potrivit este cel de inginerie biologic. 'copul biotehnologiilor const n utilizarea bacteriilor, levurilor, celulelor vegetale i animale a cror metabolism i a cror capaciti de biosintez sunt orientate ctre obinerea de substane specifice. 4ceste biotehnologii ofer posibilitatea ca pornind de la resurse larg disponibile s se obin o mulime de substane i compui eseniali pentru via. 4plicate la scar industrial, aceste biotehnologii constituie bioindustria care cuprinde pe de o parte activiti industriale n cadrul crora biotehnologiile pot nlocui tehnologiile folosite n mod curent i pe de alt parte activitile industriale n care biotehnologiile au un rol esenial. 4ctivitile industriale n care biotehnologiile au un rol promotor cuprind industria alimentar (producia de biomas levurian, algal i bacterian n vederea obinerii de proteine, 44, vitamine, enzime), domeniul creterii productivitii agricole, industria farmaceutic (obinerea de vaccinuri, sinteza de hormoni, de interferoni i antibiotice), protecia mediului ncon+urtor i lupta mpotriva polurii (tratarea apelor uzate, transformarea resturilor mena+ere, fabricare compuilor biodegradabili). 'pecialitii ridic urmtoarea ntrebare5 16or fi biotehnologiile un panaceu pentru rezolvarea diverselor probleme cu care se confrunt mai ales rile n curs de dezvoltare72. 8spunsurile la aceast ntrebare vor trebui s ia n considerare situaiile diverse e$istente n aceste ri, deoarece unele dintre ele au un bun nivel de cercetare tiinific i tehnologic, o baz industrial dezvoltat care asigur implementarea unor noi biotehnologii. 9hiar i rile mai puin avansate biotehnologic i tiinific pot beneficia de progresele nregistrate n biotehnologii datorit reelei de cooperare regional i internaional. n concluzie, biotehnologiile cuprind un ansamblu de procedee de transformare a materiilor prime i de producere cu a+utorul culturilor de microorganisme i de celule animale i vegetale a unei mari varieti de substane utile omului. "erfecionarea acestor biotehnologii i dezvoltarea lor ca rezultat a recentelor descoperiri de biologie molecular vor produce schimbri profunde pe plan economic i social, deoarece activitile bioindustriale privesc producia agricol, nutriia, tratarea i prevenirea unor boli, satisfacerea nevoilor de energie i protecie a mediului ncon+urtor.

( (

n biotehnologii se disting mai multe direcii de dezvoltare5 %. :odernizarea proceselor fermentative clasice prin introducerea tehnologiilor informatice i selectarea unor tulpini special cultivate pentru creterea randamentelor. (. -ermentaii bazate pe imobilizarea unor enzime pe suporturi polimerice. .. ;ngineria genetic i tehnica 40<!recombinant pentru folosirea enzimelor de restricie i a ligazelor. 4v#nd la baz ingineria genetic, biotehnologiile i vor gsi un spaiu larg de aplicare n urmtoarele domenii5 %. Biomedicin i farmacologie n aceast direcie se obin vaccinuri pentru unele maladii virale (hepatita 4 i B, herpes, poliomielit), a interferonului, a hormonilor de cretere uman, a enzimelor, a unor proteine specifice, a unor noi tipuri de antibiotice, de vitamine i unele medicamente. 'e prevd urmtoarele direcii de cercetare tiinific5 9larificarea funciilor i mecanismelor de aciune a regulatorilor imunologici= ;nvestigaii cu peptide neuroactive, trombolitice i fibrinolitice= 9larificarea mecanismelor imunitii= nelegerea fiziologiei i aspectelor genetice ale cancerului. (. 4gricultur i industria alimentar n aceast direcie se urmrete obinerea unor hibrizi i soiuri mai productive i mai rezistente la boli. 'e urmrete de asemenea procesul biologic de fi$are a azotului din atmosfer i procedee de manipulare genetic cum este transferul embrionar i tehnica 40<!recombinant pentru obinerea unor rase de animale i de psri. 'e urmrete de asemenea producia de enzime, de 44, antio$idani, obinerea de noi pesticide, de medicamente de uz veterinar, de obinerea unor compui aromatici, precum i de ageni de diagnostic. .. "roducia de energie 'e urmrete producia biocombustibililor gazoi, lichizi, a biocarburanilor din fitomas, precum i posibilitatea fabricrii hidrogenului pe cale biologic sau creterea capacitii de e$tracie a zcmintelor de petrol prin metode biotehnologice.

. .

>. "roducia de materii prime n aceast direcie se preconizeaz utilizarea biomasei reziduale, conversia biomasei reziduale n materii prime ce pot fi utilizate n continuare n industria chimic. n acelai timp se va urmri producia de proteine, lipide i zaharide, de acizi organici, 44, glicerol, precum i transformarea i obinerea gazului metan din deeuri vegetale, de+ecii animale i din apele mena+ere oreneti i industriale. /. ?$tracia materiilor prime minerale i protecia mediului ncon+urtor n acest scop se vor folosi tehnologiile microbiologice de e$tracie a unor metale i metaloizi din minereuri srace, precum i descompunerea biologic i combaterea unor poluani ai mediului ncon+urtor.

Particularitile biotehnologiei ca tiin

4naliza particularitilor biotehnologiei ca tiin scoate n eviden c#teva caracteristici eseniale5 %. n primul r#nd activitatea biotehnologic necesit convergena unui numr mare de cunotine disciplinare n care graniele dintre cercetarea fundamental, aplicativ i industrial se terg. 't#lpii de rezisten sunt reprezentai de microbiologie, genetica microorganismelor, inginerie genetic, biochimie i bioinginerie industrial. (. "osibilitile foarte mari de aplicare a realizrilor proprii n producia industrial. n acest sens este de menionat c nu e$ist o ramur industrial de biotehnologie, ci ntreprinderi care utilizeaz biotehnologiile n sectoare diferite. .. 9ercetarea biotehnologic este ntotdeauna de lung durat i necesit o succesiune de competene, ncep#nd cu cercetarea fundamental p#n la e$periena industrial, respectiv valorificarea cunotinelor. >. 9ondiiile succesului n biotehnologii sunt determinate de urmtorii factori5 o cercetare fundamental avansat, investiii adecvate, spirit ntreprinztor, e$istena unor cadre specializate cu o pregtire de baz solid, interdisciplinar.

Biotehnologiile i mediul

> >

Biotehnologiile, implic#ndu!se n ciclurile biologice i geochimice naturale, a+ut la intensificarea unor fenomene naturale, la controlul lor fiind uneori instrumente pentru repararea unor intervenii umane sau uneori de obinere a unor avanta+e pentru om. Biotehnologiile ncearc s e$ploateze anumite microorganisme n lupta mpotriva altor ageni patogeni pentru om i pentru mediul nco+urtor. 'e tie c bacteriile sunt artizanii ciclurilor biologice ale carbonului, azotului, o$igenului, sulfului. ?fectele modificrilor acestor cicluri acioneaz n primul r#nd asupra metabolismelor naturale, iar secundar, dac observm numai efectul de ser, conduce la o izolare i nclzire a globului, la topirea ghearilor, la modificarea climei. Bacteriile din ocean asigur fi$area a peste /)@ din acest ciclu. 0ac acest proces de mineralizare se ntrerupe, se poate a+unge la dispariia planetei. Bacteriile degradeaz materia organic, produc gaz carbonic pe care organismele vegetale superioare l fi$eaz la lumina solar, obin#ndu!se proteine ce constituie hrana omului i a animalelor. :ai departe, bacteriile descompun deeurile organice produse de acestea. 4zotul inhalat odat cu aerul este eliminat prin procesul de e$piraie, fiind apoi fi$at i utilizat sub form de compui ca <A., nitrat de ctre bacterii, furniz#nd o mare parte din proteinele necesare pentru creterea bacteriilor. Bi de aceast dat, /)@ din azotul atmosferic, din sol sau ap este adus la stadiul de compui asimilabili pentru plante, proces realizat cu a+utorul bacteriilor. ?cologia microbian a solului ne arat c diferite microorganisme din sol realizeaz un echilibru i fiecare specie este important n lupta mpotriva paraziilor i a insectelor duntoare. Biotehnologiile furnizeaz o nou ans pentru modificarea statutului omului prin cunoaterea i intervenia n mecanismele naturale pe care natura le propune. 3na dintre marile sarcini ale biologiei n natur este stp#nirea ciclului azotului fr de care n!ar e$ista proteine, acizi nucleici, clorofil, pigmeni respiratori etc. "rin biotehnologii s!a realizat p#n acum o mai rapid fi$are direct a azotului de ctre unele bacterii datorit enzimei nitrogenaza. 4ceast enzim convertete azotul n <A ., fc#ndu!l astfel asimilabil de ctre plante. ?nzimele fi$atoare de azot au beneficiat de ingineria genetic, deschiz#ndu!se un domeniu de importan deosebit de interes economic. 3n rol important l prezint micorizele, cu rol n fi$area fosforului esenial pentru sntatea pdurilor i a altor culturi. Biopesticidele, substane obinute prin procese de sintez, au o importan deosebit n combaterea duntorilor. 0omeniul farmacologiei celulare este n plin dezvoltare. ?ste nevoie de vaccinuri, deci se pot implica biotehnologiile n numeroase procese. "#n nu demult, obinerea de vaccinuri se fcea prin procedee ndelungate, vaccinuri care aplicate omului duc la apariia anticorpilor protectori. 4stzi numeroase vaccinuri se obin prin inginerie genetic.

/ /

Substane utile produse prin biotehnologii

4plicaiile biotehnologiilor moderne n industria alimentar i a fura+elor sunt considerabile. ?ste vorba n primul r#nd de proteinele monocelulare neconvenionale produse cu a+utorul levurilor, utiliz#ndu!se o gam variat de substraturi5 parafine, grsimi reziduale, zerul din industria laptelui, melasa din industria zahrului, metanolul etc. '!au dezvoltat de asemenea biotehnologiile pentru sinteza de 44 eseniali (lizina i acidul glutamic) cu a+utorul unor bacterii. 4ceti 44 sunt utilizai n hrana animalelor i a omului pentru mbogirea alimentaiei n substane nutritive valoroase. *ot n industria alimentar se folosesc cu mult eficien enzimele produse prin biotehnologii, cum sunt amilazele, proteazele, pectinazele, celulazele. 3nele dintre aceste enzime sunt utilizate i n alte domenii de activitate. 0e e$, utilizarea enzimelor n hidroliza enzimatic a amidonului cu a+utorul unei tulpini de Bacillus licheniformis. 4cest bacil poate aciona i la temperaturi de peste %)) C9. 9a urmare, hidroliza amidonului se realizeaz at#t sub aciunea temperaturii ridicate, c#t i a enzimei D!amilaza. "e plan mondial se produc n acest mod c#teva milioane de tone de zahr din porumb. O categorie aparte de proteine monocelulare neconvenionale (single!cell!proteins) se obin din cultivarea dro+diilor, procedeu biotehnologic foarte important. n vederea realizrii unor astfel de culturi de dro+dii pe scar industrial se folosesc diverse substraturi ca surs de 9 necesar producerii de proteine. "rimele cercetri n aceast direcie s!au realizat prin cultivarea dro+diilor pe parafine n bioreactoare n care se introduc parafinele, amoniac (care reprezint sursa de < i care menine pA! ul mediului) i apoi dro+diile (fie Candida, fie Saccharomyces). 0ro+diile o$ideaz hidrocarburile n acizi grai cu a+utorul unor enzime de tipul hidro$ilazelor, dup care acizii grai sunt degradai cu acetil!9o4 i transformai n proteine celulare. 9antitatea de proteine din substana uscat a acestor dro+dii reprezint cca. /)@. "entru prepararea unor mari cantiti de astfel de proteine monocelulare s!au construit uzine speciale cu bioreactoare uriae n care n mod automat sunt controlate condiiile de mediu pentru a se obine o cretere rapid a masei celulare. "entru obinerea de proteine monocelulare cu a+utorul dro+diilor se pot utiliza i alte substraturi ca zerul din industria laptelui, grsimile reziduale din abatoare etc. 3nul din marii productori de proteine monocelulare este 8usia. n multe alte ri s!au dezvoltat procedee de obinere de proteine monocelulare din cauza creterii nevoilor de proteine pentru nutriia E E

animalelor. 0ro+diile reprezint din acest punct de vedere organisme ideale deoarece au un ciclu de via scurt i dau o productivitate foarte mare. '!au cutat i alte substraturi mai ieftine care s poat suplini hidrocarburile. '!a folosit astfel metanolul, un alcool simplu obinut prin o$idarea gazului metan sau derivat din crbune. '!a constatat c valoarea nutritiv a proteinelor monocelulare este ridicat. 0e aceea se preconizeaz pentru dezvoltarea produciei de proteine construirea unor instalaii relativ mici care s poat valorifica la nivelul unor localiti mici diferite substraturi reprezentate n primul r#nd de deeurile produciei agricole.

Biotehnologiile n industria farmaceutic

"rintre primele aplicaii ale biotehnologiilor pot fi citate cele care au implicaii n industria farmaceutic. 9u a+utorul biotehnologiilor moderne se fabric n prezent o mare varietate de medicamente de uz uman sau veterinar ca antibiotice, hormoni, vitamine, vaccinuri, anticorpi monoclonali, interferoni, ageni tuberculostatici, medicamente antifungice etc. "rogrese spectaculoase n biotehnologia sintezei de medicamente s!au nregistrat n special dup ce s!au elaborat metode de transfer de gene prin tehnici de inginerie genetic. 'inteza hormonilor a beneficiat din plin de aceste tehnici moderne. 0e e$, somatostatina, primul hormon uman sintetizat cu a+utorul bacteriilor recombinate genetic n %&,,. 0e e$, insulina, hormonul hipoglicemiant, n absena cruia apare diabetul zaharat. "#n nu demult insulina folosit n terapia diabeticului era e$tras din pancreasul de bovine i de porc. n %&,& o echip de cercettori americani de la 3niversitatea din 9alifornia a sintetizat cele ( gene implicate n sinteza insulinei, gene care au fost apoi incluse ntr!o plasmid i transferate n celula bacteriei Escherichia coli. 4ceast insulin obinut prin inginerie genetic prezint marele avanta+ c este identic structural i funcional cu cea uman i nu produce efecte secundare. 3n alt hormon i anume somatotropinaFhormonul de cretere sintetizat n hipofiz, a crei absen din organism produce nanismul hipofizar. 4cest hormon se obinea din hipofiza cadavrelor n cantiti infime. n prezent, prin tehnici de inginerie genetic s!a reuit transferul genei care determin sinteza acestui hormon la bacteria E. coli care se cultiv uor, se multiplic rapid i sintetizeaz o cantitate mare de hormon de cretere. Biotehnologii de obinere a hormonilor steroizi

, ,

'inteza acestor hormoni ilustreaz n mod e$cepional importana biotehnologiilor moderne pentru producerea lor pe scar industrial. 'e preconizeaz n viitor i sinteza altor hormoni necesari n terapeutica medical uman i veterinar. Biotehnologii de obinere a interferonului ;nterferonul reprezint o clas de proteine cu proprieti antivirale i antitumorale. ;nterferonul a putut fi sintetizat cu a+utorul culturilor de celule umane. n %&G) cercettorii Hilbert i Ieissman au reuit s transfere genele interferonului la bacteria E. coli. ?i au e$tras 48<!ul mesager al genelor respective i cu a+utorul enzimei revers!transcriptaza au reuit s sintetizeze secvena de 40< corespunztoare genelor respective. 4ceast secven de 40< a fost apoi inclus ntr!o plasmid care a fost transferat n celulele de E. coli. n %&G% genele interferonului au fost transferate de ctre cercettorii americani n celulele dro+diei Saccharomyces cerevisiae, fiecare celul de dro+die fiind capabil s sintetizeze p#n la %)E molecule de interferon. "rin transferul genelor interferonului n celule bacteriene sau de dro+dii o seam de laboratoare i societi de inginerie genetic din '34, Japonia, 4nglia, -rana, ;srael, 'uedia i altele au nceput producia industrial de interferon, acesta fiind de ()) de ori mai ieftin dec#t cel produs prin culturi de celule umane. Obinerea de vaccinuri n prezent se urmrete producerea de vaccinuri de uz uman sau veterinar prin tehnici de inginerie genetic. 9u a+utorul bacteriilor se sintetizeaz numai proteinele sau antigenele fa de care organismul reacioneaz imunologic, produc#nd anticorpi. *ehnologia clasic n care se foloseau agenii infecioi atenuai sau omor#i prezenta un anumit grad de periculozitate. 'e urmrete n prezent obinerea de vaccinuri pe cale biotehnologic contra febrei aftoase, maladie viral foarte contagioas, care afecteaz bovinele, ovinele i porcinele. 0e la animale, boala poate fi luat i de om. 4cest virus este alctuit dintr!o molecul de 48< monocatenar ncon+urat de o capsid format din > tipuri de proteine, fiecare tip reprezentat de c#te E) de molecule. '!a reuit producerea unui vaccin mpotriva febrei aftoase prin biotehnologii moderne, respectiv prin transferul genelor ce determin sinteza proteinelor virale n celulele bacteriei E. coli. 'ocietatea de ;nginerie Henetic Henemtech a nceput s produc i s comercializeze acest vaccin nc din %&G>.

G G

Aepatita B este o maladie foarte rsp#ndit care determin tulburri grave n structura i funciile ficatului i uneori chiar cancerul hepatic. 4cest virus al hepatitei B are un genom format dintr!o macromolecul de 40<, format la r#ndul ei din .()) de nucleotide i o nucleocapsid care conine antigenele de suprafa reprezentate n special printr!o polipeptid. 4ceast polipeptid are o greutate molecular de %&))) 0a. 4ntigenele acestui virus sunt notate astfel5 ABs i ABe. 4ceste antigene sunt sintetizate sub controlul a ( gene diferite. nc din %&G) o echip de cercettori francezi de la ;nstitutul "asteur din "aris a reuit s realizeze proteinele virusului hepatitei B cu a+utorul bacteriilor. 4stfel, genele virale care determin sinteza antigenelor au fost transferate n celulele bacteriene de E. coli care au nceput s sintetizeze proteinele virale. 4poi, aceste proteine sintetizate n celulele bacteriene au fost folosite la prepararea vaccinului mpotriva hepatitei B care determin formarea de anticorpi protectori n organismul vaccinat. n %&G% la 3niversitatea din 9alifornia s!a reuit transferul genelor virusului hepatitei B care determin sinteza proteinelor din care se prepar vaccinul n celulele de S. cerevisiae. n mod similar, cu a+utorul bacteriilor i a dro+diilor recombinate genetic in vitro se pot obine vaccinuri mpotriva a numeroase maladii virale, ca de e$, poliomielita, turbarea i altele.

Producerea de energie cu ajutorul microorganismelor

9riza energetic a ndreptat atenia specialitilor spre alte surse neconvenionale de energie care s poat suplini parial nevoile sociale. O atenie deosebit s!a acordat bioenergiei pornind de la faptul bine cunoscut c prin fotosintez se produc anual cantiti uriae de materie organic din care numai o parte este utilizat direct n alimentaie sau n hrana animalelor. 'ubprodusele rezultate din agricultur i deeurile reprezint cantiti uriae de biomas care ar putea fi utilizate pentru producerea de energie. 4nual, agricultura furnizeaz prin cultura cerealelor o cantitate de %,, miliarde de tone de paie care n mare msur rm#n neutilizate. n general, din procesul de cultur a plantelor agricole din industria alimentar se acumuleaz mari cantiti de celuloz, amidon, melase, deeuri de lignin la care se adaug deeurile mena+ere, toate acestea reprezent#nd o mare cantitate de materie organic. 4ceste produse pot fi valorificate eficient pentru producerea de bioenergie. n unele ri se fac cercetri intense pentru cultivarea unor plante care s fie utilizate pentru producia de alcool etilic (cartoful, unele cereale, trestia de zahr etc.). 4ceste produse sunt bogate n glucide de tipul amidonului i zaharozei care pot fi uor hidrolizate n he$oze care apoi sunt supuse fermentaiei alcoolice rezult#nd alcoolul etilic. 0ezvoltarea produciei de alcool etilic cu

& &

a+utorul microorganismelor se face pentru folosirea lui n calitate de carburant la motoarele cu combustie intern. 4midonul, care constituie peste /)@ din substana uscat a boabelor de cereale, a cartofului etc. poate fi hidrolizat enzimatic sau cu acizi, obin#ndu!se de$trine i glucoz. 4cest zahr este utilizat pentru fermentare, obin#ndu!se alcool etilic folosit n diferite industrii. Aemicelulozele constituie un grup de poliozide asociate celulozei din peretele celulelor vegetale. 3nele bacterii sunt capabile s degradeze hemicelulozele la o temperatur de peste >) C9 i s le transforme n alcool etilic i acid lactic. 9eluloza este degradat de bacterii i fungi care conin comple$ul enzimatic celulaza. "rin transformarea cu a+utorul microorganismelor a celulozei i hemicelulozei se obin, pe l#ng alcool etilic, o serie de alte produse ce servesc ca materii prime n industria farmaceutic, chimic, alimentar. 6alorificarea acestei cantiti foarte mari de biomas va contribui totodat la epurarea biologic a mediului ncon+urtor i implicit la ameliorarea condiiilor de via ale populaiei.

Producerea de biogaz
?ste o alt cale de transformare a biomasei, fiind vorba de o fermentare metanic denumit metanogenez. :etanogeneza este o fermentaie anaerob n care intervin . grupe de bacterii5 %. Hrupul care transform substratul organic n acizii butiric, propionic i lactic= (. Hrupul care transform aceti acizi organici n acid acetic, A( i 9O(= .. Hrupul de bacterii care reduc 9O( n 9A> i consum A(. *oate bacteriile metanogene au capacitatea de a crete n prezena A ( i a 9O(, ele sunt sensibile la prezena O( care este to$ic pentru ele i produc 9A > n urma activitii lor biologice. ;nstalaiile de obinere a biogazului au fost construite i recomandate pentru gospodriile rurale unde e$ist multe deeuri organice, c#t i n cazul fermelor de cretere a animalelor unde rezult cantiti mari de gunoi. 9ercettorii din Japonia au obinut o nou tulpin de bacterie metanogen care produce fermentaia metanic n numai G zile spre deosebire de tipul clasic de fermentaie care are nevoie de K () de zile. "e plan mondial, o e$perien valoroas de obinere a biogazului s!a acumulat n 9hina, ;srael, ;ndia, -ilipine, -rana etc.

Bioexploatarea petrolului i a minereurilor

% %)

n ultima vreme s!au dezvoltat o serie de biotehnologii care permit recuperarea secundar a petrolului din zcminte i e$tracia unor metale din minereul n care sunt incluse. "rin mi+loacele tehnice actuale numai cel mult >)@ din cantitatea de petrol a unui zcm#nt poate fi e$ploatat industrial. 0e aceea, au nceput studii intense pentru valorificarea microbiologic a zcmintelor de hidrocarburi, fapt care conduce la o mrire substanial a cantitii de petrol ce poate fi e$tras dintr! un zcm#nt. 4cest lucru se realizeaz prin introducerea n zcm#nt a unor microorganisme selecionate care mresc presiunea n profunzimea solului, cresc porozitatea rocilor, reduc v#scozitatea petrolului i astfel petrolul poate fi recuperat i e$ploatat mult mai uor. Bacteriile folosite n acest scop sunt cultivate pe un mediu nutritiv (de e$, pe melas), mediu pe care l transform obin#ndu! se gaze, acizi, solveni, biopolimeri etc. 9O(!ul produs pe aceast cale se dizolv n zcm#nt i reduce v#scozitatea ieiului, iar gazele rmase ca atare mresc presiunea zcm#ntului. 4lte substane rezultate n urma aciunii microorganismelor (de e$, alcoolii, cetonele) reduc aderena dintre iei i roc, mrind n acelai timp porozitatea rocii.

ombaterea polurii cu produse petroliere

n procesul de producere, transport i depozitare a petrolului are loc de multe ori o poluare a mediului ncon+urtor terestru i acvatic, fapt ce afecteaz flora i fauna ncon+urtoare. 0in cauza unor accidente are loc deversarea n apa mrii a unor cantiti mari de hidrocarburi, polu#nd foarte grav, pe suprafee ntinse, apa mrilor. "entru combaterea polurii cu hidrocarburi se folosesc n special bacterii din specia Pseudomonas putida care posed enzime o$idoreductoare sau pentru hidro$ilare, astfel c ele pot degrada diferite clase de hidrocarburi sau de compui aromatici to$ici, ca de e$ benzen, toluen. 4ceast bacterie prezint gene localizate n plasmide care determin sinteza diferitelor enzime implicate n degradarea petrolului. '!a constatat c diferite tulpini ale bacteriei Pseudomonas putida sunt capabile fiecare n parte s degradeze numai o anumit clas de hidrocarburi, astfel c eficiena lor n combaterea polurii este relativ redus datorit faptului c petrolul conine un amestec de diferite hidrocarburi. "entru a mri eficiena bacteriilor respective, un grup de cercettori de la 3niversitatea ;llinois din '34 a folosit tehnici de inginerie genetic n vederea obinerii unei tulpini bacteriene recombinate genetic in vitro capabil s metabolizeze diferite componente ale ieiului. n acest scop, aceti cercettori au utilizat > tulpini bacteriene care posed > tipuri de plasmide ce conin gene care determin sinteza de enzime ce intervin n metabolizarea unei anumite clase de substane. '!a obinut astfel prin recombinare genetic in vitro o tulpin tetraplasmidic % %%

capabil s intervin n metabolizarea tuturor componentelor petrolului, tulpin care s!a dovedit mult mai eficient dec#t fiecare din cele > tulpini luate n parte. 4ceast bacterie multiplasmidic crete rapid pe medii de cultur care conin petrol, metaboliz#nd n timp scurt i complet mari cantiti de petrol.

Bioexploatarea minereurilor
"rocesul de recuperare a metalelor cu a+utorul bacteriilor poart denumirea de licsiviere. :icroorganismele implicate n acest proces sunt chimiolitotrofe, adic i obin energia necesar proceselor metabolice din o$idarea substanelor minerale. 0e asemenea, ele sunt autotrofe n sensul c obin carbonul necesar sintezei diferitelor structuri celulare nu din materii organice, ci din 9O ( din atmosfer. n ultima vreme s!au ntreprins cercetri intense privind posibilitatea folosirii biotehnologiilor moderne n e$ploatarea industrial a minereurilor. "rocesul de licsiviere este de ( feluri5 licsiviere direct i licsiviere indirect. n cazul licsivierii directe, bacteriile atac cu a+utorul aparatului lor enzimatic compuii minerali susceptibili de o$idare. "entru a obine energie din substanele minerale respective, bacteriile transfer electroni de -e sau de 9u asupra O, produii cei mai o$idai fiind de regul i cei mai solubili. n cazul licsivierii indirecte, bacteriile o$ideaz -e!ul feros solubil n -e feric care este un o$idant puternic reacion#nd cu alte metale pe care le transform n ioni o$idai solubili ntr!o soluie de A('O>. n acest proces reapare -e!ul feros care este rapid reo$idat de bacterii. 0atorit prezenei -e!ului n ma+oritatea minereurilor, bacteriile care fac licsivierea direct sau indirect permit o rapid acumulare a metalelor sub forme solubile n apele reziduale. 0e fapt, acest proces are un caracter comple$, n el intervenind i alte procese chimice i microbiologice. "entru a se asigura un proces de licsiviere c#t mai intens este nevoie s se asigure o serie de condiii care s favorizeze procesele microbiologice i chimice cum sunt5 4ciditate ridicat deoarece -e!ul feric i alte metale nu sunt solubile dec#t ntr!un mediu acid= *emperatur corespunztoare diverselor specii de microorganisme, de obicei mai ridicat dec#t temperatura mediului ambiant= 4erisirea minereurilor respective. 'e cunosc multe specii de microorganisme chimiolitotrofe care acioneaz n diverse condiii de mediu. 4ceste microorganisme triesc n condiii nefavorabile altor specii i anume un mediu % %(

acid bogat n A('O> i n metale solubile, un mediu srac n substane organice, la temperaturi ridicate, adesea peste /) C9. 3na dintre primele specii de microorganisme care asigur licsivierea este Thiobacillus ferooxidans. 4ceast bacterie este acidofil, put#nd tri n condiiile unei concentraii ridicate de A('O> i la temperaturi cuprinse ntre () i ./ C9. 4ceast bacterie este rsp#ndit n apele termale, n zcmintele de ', n craterele vulcanice. O alt bacterie din acelai gen este Thiobacillus thiooxidans care are o activitate similar cu a speciei precedente. 4ceste ( specii acioneaz simultan i au o eficien sporit comparativ cu activitatea lor separat. O alt categorie de microorganisme folosite n licsiviere este reprezentat de 4rchaebacterii. 0intre acestea, cel mai important este genul Sulfolobus care cuprinde specii ce triesc la temperaturi ridicate peste E) C9 n medii foarte acide. 4ceste bacterii i obin energia necesar prin o$idarea sulfului i fierului, iar carbonul l iau din 9O( sau din compui organici simpli. 4ceste bacterii sunt rsp#ndite n apele termale i acide i n crpturile vulcanilor. ?laborarea unor biotehnologii n care sunt folosite diferite specii de microorganisme pentru obinerea de substane utile omului a creat premisele i pentru utilizarea unor microorganisme n vederea regenerrii apelor reziduale rezultate din diverse industrii, ape ncrcate cu diverse substane to$ice i cu metale. 4 devenit astfel posibil recuperarea unor metale valoroase din aceste ape reziduale. 'e cunosc . tipuri de procese microbiologice prin care se pot e$trage metalele din apele reziduale i anume5 a. *ransformarea chimic a metalelor cu a+utorul unor procese biologice. b. 4dsorbia metalelor la suprafaa celulelor microbiene. c. -i$area intracelular a metalelor. '!a demonstrat e$perimental c dro+dia de bere (Saccharomyces cerevisiae) i fungii din genul Rhizopus sunt capabile s adsoarb uraniul din apele reziduale datorit faptului c prezint pe membrana i peretele celular grupe de atomi cu sarcini electrice negative astfel c adsorb ionii metalici cu sarcini pozitive. Bacteria Pseudomonas aeruginosa poate acumula intracelular metale to$ice ntr!o concentraie mare. ?$perimental s!a constatat c n mai puin de %) secunde aceast bacterie acumuleaz n celul cca. %)) mg de uraniu per litru de soluie, ceea ce reprezint p#n la /E@ din substana uscat a bacteriilor respective. 0in acest motiv, aceste bacterii au fost denumite 1adevrate bacterii sinucigae2.

% %.

Organisme folosite ca biocatalizatori

Biotehnologia i!a propus ca scop selecia unor biocatalizatori, motiv pentru care s!au studiat un numr mare de organisme (vegetale, animale, microorganisme), dar dintre toate acestea foarte puine au fost descrise ca fiind biocatalizatori. 0ezvoltarea noilor biotehnologii a schimbat esenial situaia datorit nevoii de a selecta o gam larg de tipuri de celule pentru diverse activiti. Hama noilor produse de natur microbian obinute pe cale microbiologic este foarte mare i include antibiotice noi, diveri ageni anticanceroi, diveri compui ce pot fi folosii n tratamentul trombozei, hipertensiunii arteriale, obezitii. 3n organism selecionat pentru un anumit scop biotehnologic depinde de o serie de criterii importante pentru optimizarea produsului sau a procesului5 9aracteristicile nutriionale, 9aracterele privind temperatura, 'tabilitatea fenotipic i genotipic a organismului, 9apacitatea de a fi supus unei manipulri genetice. :icroorganismele sunt foarte adaptabile i de nenlocuit n ceea ce privete capacitatea lor de a rspunde la fluctuaiile ma+ore ale mediului. O astfel de variabilitate fenotipic este folosit ca o potenial surs de rezolvare a multor probleme biotehnologice. 0ac condiiile de mediu nu sunt respectate, variabilitatea fenotipic poate duce la pierderea sau diminuarea proprietilor dorite ale productorului. -iziologia microorganismelor cu o dezvoltare lent sau care nu se dezvolt deloc a fost un subiect mai puin studiat. 9unoaterea ns a acestei probleme a devenit foarte important pentru operarea n laborator a celulelor imobilizate. n acest fel, stabilitatea speciei i stabilitatea metabolic n condiii de non!cretere sunt probleme prioritare de cercetare. Biotehnologia are la baz activitatea catabolic a tuturor tipurilor de celule. 'e pornete de la ideea c toate tipurile de celule au anumite caracteristici comune5 Barier osmotic semipermeabil reprezentat de membrana citoplasmatic= % %>

;nformaie genetic codificat n 40<= 9onin 48< implicat n transcripia i translaia informaiei genetice de la 40< la proteine. *oate celulele au deci aceste proprieti comune, dar formele n care celulele se manifest n

natur sunt foarte diverse.

0intre microorganisme, reprezentative sunt celulele bacteriene i bacteriofagii (virusuri care paraziteaz bacteriile). Bacteriofagii sunt importani pentru biotehnologie din ( puncte de vedere5 %. "ot liza diferite organisme, duc#nd la pierderi economice foarte mari mai ales n procesele de fermentaie. (. 'unt foarte utili pentru studii genetice, fie n scopul localizrii poziiei genelor, fie pentru a da natere unor specii noi, fie n procesele genetice de transducie i recombinare. 0intre procariote, reprezentative sunt bacteriile i cianobacteriile. "rodusele de fermentaie derivate de la procariote sunt5 biomasa celular, produii finali (solveni sau acizi), metabolii primari (44, enzime, nucleotide), metabolii secundari (antibiotice, pigmeni, polizaharide). n prezent un efort considerabil este direcionat spre dezvoltarea unor noi procese folosindu! se specii obinute prin tehnica 40<!recombinant. "rin aceast tehnic 40<!ul strin este introdus n culturi bacteriene sau culturi tisulare, celula gazd produc#nd astfel proteine codificate de 40<! ul nou introdus. ?$emple de produi obinui astfel pot fi hormonii animali i umani proteinele imunogene. n toate procesele industriale forma fizic a celulelor este foarte important. 0e asemenea, compoziia mediului de cultur poate influena metabolismul celulelor direct, prin nutriie sau indirect, prin alterarea formei de cretere sau influen#nd o serie de factori ca de e$, eficacitatea aeraiei. 0intre eucariote, reprezentative sunt algele, protozoarele i fungii. 4lgele i protozoarele nu prezint importan deosebit pentru biotehnologie, n schimb fungii sunt folosii pentru producerea unui numr mare de produi de fermentaie. 4lgele nu se cultiv industrial n reactoare nchise, dar producerea de biomas se poate realiza prin tratarea apelor reziduale cu alge verzi unicelulare de tipul Chlorella i Scenedesmus. 0in algele marine se fac e$tracii de produse e$celente pentru gelificare (agar). -ungii unicelulari de tipul dro+diilor sunt ageni e$celeni de fermentaie. -ungii din genurile Penicillium i spergillus prezint o mare importan n biotehnologie.

% %/

9elulele animale pot fi crescute ca celule de sine stttoare sau ca fragmente de esuturi. "rimele culturi de celule animale au fost fcute din celule recoltate direct de la animale. 4ceste celule sunt diploide i prezint aa!numita inhibiie de contact, ceea ce nseamn c ele se opresc din cretere atunci c#nd a+ung n contact ntre ele. 9elulele primare nu supravieuiesc de regul pasa+elor repetate din cultur. 0up aceste treceri repetate, celulele primare se transform, put#nd supravieui i devenind celule stabile sau transformate. 4ceste celule se multiplic mult mai rapid i sunt lipsite de inhibiia de contact. 4ceste celule transformate pot fi cultivate la nesf#rit. Liniile celulare transformate constau de obicei dintr!un singur tip de celule, dar n general liniile celulare pot conine mai mult de un tip celular. 4a!numitele linii celulare standard deriv de la om, maimu, pisic, obolan, c#ine etc. ?le pot fi obinute de laboratoare prin solicitare la casele de colecii cu tipuri de culturi. :ediile de cultur pentru celulele animale conin sruri minerale tamponate, glucoz, vitamine, 44, factori de cretere, ser i e$tract fMetal. 9elulele vegetale. Nesuturi provenite de la o gam larg de plante pot fi crescute pe mediu solid (calus) sau n suspensie. *ehnicile i mediile de cultur folosite pentru a crete aceste celule vegetale sunt similare cu cele folosite la celulele animale cu e$cepia aportului de lumin, iar e$tractul fMetal i serul se nlocuiesc cu e$tracte de plante, cu adaos de citochinine, de acid indolilacetic, naftalilacetic i altele. 9elulele vegetale au o rat metabolic mai mic dec#t microorganismele aerobe astfel nc#t rata de transfer a o$igenului n reactoarele de cretere a celulelor vegetale nu este foarte mare, iar gradul de agitare trebuie s fie adecvat pentru a se mpiedica o sedimentare a celulelor.

!icroorganisme utilizate n biotehnologii

:icroorganismele care sintetizeaz diverse produse sunt n numr de c#teva sute de specii din cele peste %)) milioane c#te se cunosc n natur. 4ceste specii aparin procariotelor i eucariotelor, respectiv la / grupe5 bacterii, actinomicete (bacterii miceliene), levuri, mucegaiuri i alge. <umai n secolul () s!au nregistrat progrese ma+ore n cunoaterea structurii i funciei acestor microorganisme, precum i a geneticilor. '!a nceput de e$emplu cu inducerea artificial de mutaii cu a+utorul radiaiilor O, al radiaiilor 36 sau cu a+utorul unor substane chimice, fapt care a condus la intensificarea procesului de selecie a unor microorganisme utile omului.

% %E

3n e$emplu n acest sens l constituie producerea de antibiotice cu a+utorul microorganismelor. *ulpini slbatice de Penicillium produceau K E) mg de penicilin per litru de mediu de cultur. 0up un proces intens de selecie realizat prin folosirea unor mutani s!au obinut tulpini capabile s produc K () g penicilin per litru de mediu de cultur, adic de peste %).))) de ori mai mult dec#t tulpinile slbatice neameliorate. Odat cu apariia ingineriei genetice s!au creat condiii favorabile pentru manipularea informaiei genetice a microorganismelor utilizate n biotehnologie pentru transferul de gene de la o specie la alta i pentru crearea de programe genetice artificiale. '!au putut astfel obine tulpini noi de microorganisme capabile s mreasc considerabil eficiena proceselor microbiologice n producerea de substane utile omului. 'peciile de bacterii folositoare fac parte din grupul ?ubacteriilor, denumite i 1bacterii adevrate2. 0e e$, bacteriile acetice cuprinse n genul cetobacter sunt bacili Hram negativi care transform etanolul n acid acetic. Henul Bacillus cuprinde bacterii Hram pozitive care formeaz endospori i care sunt ncon+urate de numeroi cili dispui peritrih. 0in genul Bacillus, specia Bacillus subtilis este o specie strict aerob, sporulat, folosit mult n biotehnologie. *ot dintre ?ubacterii fac parte i cele incluse n genul Clostridium. 'unt bacterii sporulate care produc fermentaii n urma crora rezult diveri produi. Bacteriile lactice sunt specii ce aparin genurilor !actobacillus, !euconostoc i Streptococcus. 'unt bacterii nesporulate, Hram pozitive, care tolereaz prezena O(. 4ceste bacterii lactice se pot mpri n ( grupe5 Bacterii lactice homofermentative care n urma fermentaiei pe care o produc, produc numai acid lactic. Bacterii lactice heterofermentative, n urma fermentaiei lor rezult#nd acid lactic, etanol i 9O(. Bacteriile lactice homofermentative fac parte din genul Streptococcus, iar cele din grupul bacteriilor heterofermentative din genul !euconostoc. Bacteriile cuprinse n genul Corynebacterium sunt bacterii imobile, Hram pozitive, nu formeaz spori, unele specii sunt patogene, iar cele nepatogene care triesc n sol prezint interes pentru industrie. 0e e$, Corynebacterium glutamicum produce lizin i acid glutamic. 4ctinomicetele (bacteriile miceliene) sunt strict aerobe, Hram pozitive i nu formeaz spori. 9el mai important gen dintre actinomicete este genul Streptomyces care cuprinde specii productoare de antibiotice. 0ro+diile sunt fungi microscopici unicelulari i formeaz un grup de microorganisme eucariote cu numeroase specii care dpdv al modului de reproducere au fost clasificate n dro+dii cu reproducere se$uat sau ase$uat. 0ro+diile aparin la . clase de fungi i anume5 4scomicete, % %,

Basidiomicete i 0euteromicete. 9ea mai veche n serviciul omului i cea mai intens cultivat este specia Saccharomyces cerevisiae. <umeroase tulpini de levuri sunt folosite pentru fabricarea vinului, a berii, a buturii saPe, a buturilor alcoolice, la fabricarea p#inii etc. 'pecia Saccharomyces lipolytica degradeaz hidrocarburile i este utilizat la fabricarea biomasei proteice. 4lte specii utile omului aparin genului Candida, cu o specie reprezentativ Candida utilis. 4ceast specie poate fi cultivat pe deeuri rezultate din industria h#rtiei. n general, levurile folosite n industrie nu se reproduc se$uat, nu formeaz spori i sunt poliploide, fapt care e$plic vigoarea lor i adaptabilitatea la schimbrile din mediu. :ucegaiurile sunt un grup de fungi filamentoi, de tip eucariot care produc numeroase transformri n mediul solid, care preced fermentaiile. 0e e$, hidroliza amidonului din orez n producerea industrial a buturii saPe. :ucegaiurile produc enzime utilizate n industrie ca amilaze, proteaze, pectinaze, acizi organici (citric, lactic etc.), antibiotice. :ucegaiurile sunt folosite i n industria de fabricare a unor br#nzeturi. 0e e$, n prepararea br#nzei de tip 8oQuefort se folosete specia Penicillium ro"ueforti. n industria obinerii br#nzei de 9amembert se folosete specia Penicillium camemberti. 'pecii de mucegai precum Penicillium chrysogenum se folosesc la obinerea antibioticului penicilina. La obinerea buturii saPe se folosete specia niger se folosete n industrie la obinerea acidului citric. 0in familia de mucegaiuri cu numele de #ucoraceae, importante sunt speciile care aparin la ( genuri5 Rhizopus (R. oryzae$R. %aponicus) i #ucor (#. %avanicus), specii utilizate n procesul de fermentaie alcoolic. 3n alt e$emplu este familia spergillaceae cu genurile mai reprezentative spergillus i Penicillium, dintre care specia spergillus niger folosit n industria de producere a acidului citric prin fermentaia glucidelor i spergillus oryzae utilizat n obinerea prin fermentaie alcoolic a sucului de orez sau saPe. 'peciile spergillus fumigatus i spergillus clavatus produc antibiotice numite fumigatina i clavacina. Henul Penicillium are ( specii importante5 P. notatum i P. chrysogenum, productoare de pencilin. spergillus oryzae. 'pecia spergillus

"iziologia microrganismelor de interes industrial

:icroorganismele n general i n special cele de interes biotehnologic au nevoie at#t pentru cretere i multiplicare, c#t i pentru producerea unor substane biologic active de prezena n mediul de cultur a celor mai adecvate substane nutritive care s conin pe de o parte elementele chimice necesare sintezei propriilor constitueni celulari, a unor enzime specifice, a sistemului de % %G

transport celular, iar pe de alt parte s furnizeze substanele necesare producerii de energie at#t pentru procesele celulare proprii, c#t i pentru procesele de biosintez a unor produi biologic activi. "rin urmare, fiecare microorganism folosit ntr!un anumit proces biotehnologic necesit un mediu de cultur a crui compoziie s!i ofere elementele necesare proceselor biosintetice. 0in grupul elementelor necesare amintim5 bioelementele, necesarul de O(, surse nutritive, surse de energie i altele. Bioelementele sunt absolut necesare microorganismelor. 4cestea au nevoie de acele elemente care constituie structura oricrui sistem biologic. 3nele au fost denumite bioelemente ma+ore, foarte importante, iar altele, necesare n cantiti foarte mici, au fost denumite bioelemente minore. Bioelementele ma+ore sunt reprezentate de 9, A, O, <, ', ", R, :g, 9a, -e, dar dintre acestea carbonul, o$igenul, hidrogenul, azotul, sulful i fosforul formeaz K &/@ din greutatea uscat a microorganismului, deci reprezint constituenii principali care trebuie inclui n componentele mediilor de cultur. 3nele elemente, precum 9, A, O, < sunt implicate n toate structurile i sintezele celulare, compuii lor furniz#nd energia necesar desfurrii proceselor metabolice. ' i " sunt implicate numai n anumite procese celulare. Bioelementele minore sunt reprezentate de Sn, :n, <a, 9l, :o, 9o, 9u. ?le sunt necesare microrganismelor n cantiti foarte mici. 3nele ca de e$ Sn i :n sunt necesare pentru toate microorganismele, n timp ce :o, 9o i 9u sunt necesare numai pentru sinteza unor enzime, precum i pentru dezvoltarea i desfurarea unor procese industriale de biosintez, ele intr#nd n structura unor molecule biologic active. 0e e$, 9o intr n procesul de sintez a vitaminei B %(, iar 9u pentru sinteza i activitatea unor enzime respiratorii. #ecesarul de O$. O( este furnizat microorganismelor n primul r#nd de diferiii nutrieni i de apa care intr n compoziia mediilor de cultur. 0atorit solubilitii sale sczute, O ( aflat n soluie este utilizat foarte repede de ctre bacteriile aerobe care se dezvolt n sistemul de cultivare. 4cest lucru face ca densitatea atins de o cultur microbian s fie mult limitat de rata de solvire a O( n lichid. n culturile aerate din flacoanele agitate necesitile de aerare sunt mai limitate. n instalaiile industriale, unde se mrete mult aria interfaei aer!lichid, n special prin folosirea tehnicii de barbotare a aerului i de amestecare a lichidelor, creterea microorganismelor este mai intens, dar poate deveni limitat atunci c#nd necesitile n O( nu sunt satisfcute corespunztor. n funcie de necesitile n O(, microorganismele se pot grupa n5 %. :icroorganisme strict (obligat) aerobe care au nevoie absolut de prezena O(, ele neput#nd tri n anaerobioz. % %&

(. :icroorganisme strict (obligat) anaerobe care nu se pot dezvolta n prezena O ( molecular i ca urmare cultivarea lor trebuie realizat n medii lipsite de O(. .. :icroorganisme microaerofile care se dezvolt cel mai bine la concentraii foarte mici de O ( n mediu. >. :icroorganisme facultativ anaerobe care au capacitatea de a se dezvolta at#t n prezena O(, c#t i n absena lui. 3nele dintre acestea, ca de e$emplu bacteriile lactice desfoar un metabolism de tip fermentativ, dar fr aer chiar i atunci c#nd cantitatea de O ( din mediu este suficient. 4lte microorganisme i orienteaz metabolismul n funcie de prezena sau absena O ( n mediul de cultur, fr s!i modifice activitile celulare. Sursele nutritive :icroorganismele utilizate n biotehnologii folosesc surse nutritive foarte diverse, dar cele mai multe necesit pentru desfurarea activitii lor un mediu de cultur n care s intre o surs de energie, o surs de 9, o surs de < i o surs de factori de cretere. Sursa de energie% "rocesele de cretere a tuturor microorganismelor sunt endogene i deci energia necesar creterii lor trebuie obinut fie din o$idarea unor componente ale mediului, fie din lumina solar. ?nergia obinut pe una dintre aceste ci este nmagazinat n substane macroergice. 0e aceea, rezervorul energetic cel mai important al microorganismelor este 4*"!ul. La bacteriile fotosintetizante i la alge, producerea de 4*" se realizeaz prin utilizarea energiei luminoase, pe c#nd microorganismele autotrofe i procur energia prin o$idarea compuilor anorganici, iar microorganismele heterotrofe din o$idarea compuilor organici. n procesele industriale, sursele cele mai importante de energie sunt sursele de 9 i de aceea, de cele mai multe ori, sursa de 9 se confund cu sursa de energie. Orientrile biotehnologice din ultimii ani au artat clar c ntre cele ( surse e$ist deosebiri nete, mai ales atunci c#nd sursa de energie este un compus necarbonat. Sursa de % n funcie de natura sursei de 9 folosit de microorganisme pentru cretere i

pentru producerea de substane active, microorganismele se pot clasifica n ( grupe5 %. :icroorganisme autotrofe care folosesc 9O( ca unic sau ca principal surs de 9 celular. (. :icroorganisme heterotrofe F organotrofe la care sursa de 9 i, n egal msur, i cea de energie este un compus organic. n cazul microorganismelor care folosesc substane organice, rolul de surs de energie este asigurat prin faptul c o$idarea sau catabolizarea lor se face cu eliberare de energie i de produi ( ()

intermediari necesari n procesele de biosintez. 0eci compuii organici cu 9 utilizai ca nutrieni sunt produii de plecare n sinteza miilor de substane organice i a produilor biotehnologici. n mod frecvent, necesarul de 9 al unei celule este suplimentat cu sursa de energie, ns bacteriile autotrofe i cele fotosintetizante folosesc 9O(. 9alea pe care microorganismele heterotrofe metabolizeaz carbonul din substrat este important de cunoscut pentru a ti c#t din ntreaga cantitate este convertit n material celular propriu. '!a stabilit c microorganismele facultative ncorporeaz K %)@ din carbonul substratului atunci c#nd calea de metabolizare este aerob. n cazul microorganismelor obligate, acestea pot ncorpora cantiti de 9 de /) T G) @ din cantitatea total de 9 din mediu. 4ceste microorganisme sunt cele mai importante pentru producerea de proteine microbiene. Sursa de #% 4zotul este necesar microorganismelor n cantiti mari, deoarece reprezint K %)@ din greutatea uscat a celulei microbiene. n celula microbian, azotul este ncorporat sub form de grupri amino. 'ursa de < poate fi reprezentat de <A. sau de sruri de amoniu pentru cele mai multe microorganisme de interes biotehnologic. 9antitatea de < necesar microorganismelor de interes industrial este n str#ns dependen cu posibilitile genetice ale productorului. '!a constatat c atunci c#nd microorganismele solicit cantiti mari de < i capacitatea metabolic de asimilare a sa este mare i deci cantitatea de produs obinut este superioar. 9ompuii organici necesitai de multe procese biotehnologice microbiene sunt relativ scumpi i de aceea s!a recurs la utilizarea unor surse la prepararea mediilor ca soia, fin de pete, e$tract de dro+dii, casein etc. "actorii de cretere% 'e tie c levurile nu se pot dezvolta pe mediile de cultur sintetice dec#t dac se adaug la mediu e$tract de levuri, e$tracte vegetale sau glbenu de ou. "rin urmare, mediul sintetic nu satisface nevoile metabolice ale levurilor. "rodusele menionate conin n ele vitamine i 44 care +oac rol de factori de cretere. La multe microorganisme factorii de cretere sunt de origine endogen, fiind elaborai prin propriile sale procese metabolice, astfel c prezena lor n mediul de cultur nu este necesar. -actorii de cretere necesari microorganismelor au fost clasificai n . categorii5 %. 4minoacizi care reprezint factori de cretere necesari n biosinteza proteinelor. (. "urine i pirimidine, factori necesari n sinteza acizilor nucleici i a unor coenzime. .. 6itaminele necesare n sinteza unor enzime i a unor coenzime.

( (%

4ceti factori de cretere, indiferent din ce categorie fac parte, sunt necesari n cantiti mici, ei +uc#ndu!i rolul ntr!un anumit moment al metabolismului productorului.

ile de conversie a surselor nutritive

:icroorganismele, ca entiti biologice, sunt echipate F dotate cu o serie de sisteme i mecanisme celulare pe baza crora reaciile biochimice care au loc la nivelul lor pot s le pun la dispoziie energia i elementele biogene care sunt preluate sau obinute din mediul de cultur. *oate aceste procese se realizeaz printr!o reea complicat i variat de procese care alctuiesc cile metabolice celulare. "rin urmare, cile metabolice nu sunt altceva dec#t secvene de reacii chimice catalizate enzimatic care permit microorganismelor s!i obin din sursele nutritive at#t compuii necesari propriilor sinteze, c#t i energia necesar realizrii acestora. La microorganisme se cunosc p#n n prezent > tipuri de ci metabolice5 %. 9i catabolice (. 9i anabolice .. 9i amfibolice >. 9i anaplerotice ile catabolice reprezint o succesiune de reacii biochimice implicate n degradarea substanelor nutritive din mediu i eliberarea de energie necesar desfurrii procesului celular. 8eaciile de catabolism evolueaz n . faze5 %. -aza care corespunde degradrii moleculelor sursei nutritive n uniti mai mici ca de e$, proteinele n 44, glucidele n he$oze, lipidele n acizi grai i glicerol. (. -aza care corespunde etapei n care aceti compui rezultai n faza anterioar sunt degradai mai departe incomplet, eliber#ndu!se o treime din energie, 9O(, ap i un numr relativ mic de intermediari metabolici. .. -aza cu o evoluie diferit n funcie de tipul de microorganisme. 0e e$, n cazul celor aerobe care metabolizeaz sursele nutritive integral, adic p#n la 9O ( i ap, calea de desfurare a acestei faze este ciclul acizilor tricarbo$ilici (ciclul Rrebs) cuplat cu un proces de fosforilare o$idativ. :icroorganismele anaerobe care nu pot efectua conversia complet a sursei de 9 p#n la 9O( i ap realizeaz aceast faz prin reacii de fermentaie ca de e$, fermentaia alcoolic, lactic, butiric, propionic etc. n care produii cilor metabolice servesc direct sau indirect ca donatori, respectiv acceptori de AU n secvene de reacii de ( ((

o$idoreducere cuplate. ?nergia care se elibereaz n acest caz este mult mai redus fa de cazul microorganismelor aerobe.

ile anabolice sunt ci de biosintez. 8eaciile biosintetice se realizeaz tot n . faze succesive, dar n sens invers dec#t n cazul catabolismului. "rocesul const n conversia micromoleculelor rezultate n faza a treia a catablismului la molecule mai mari ce reprezint faza a doua i mai departe acestea se asambleaz n macromolecule de proteine, lipide sau glucide. ile amfibolice sunt acele ci metabolice care ndeplinesc n acelai timp funcia de eliberare de energie i cea de furnizare a unor precursori pentru biosintez. 4ceste ci au fost descoperite prin studii cu un mutant de ?. coli incapabil s formeze citrat i lipsit de posibilitatea de a o$ida glucoza. 4cest mutant i obinea energia pe o cale nespecific, calea glicolitic, deci era incapabil de a utiliza ciclul Rrebs i de a sintetiza acidul glutamic i familia de 44 derivai din acesta. 9a urmare, acest mutant nu se putea dezvolta pe medii lipsite de glutamat sau D!cetoglutarat i se dezvolta foarte bine pe medii care conineau ca unic surs de 9 acidul glutamic sau precursorul su, prolina. n aceste condiii, dei formarea de citrat este blocat, reaciile din acele pri ale cilor centrale neafectate de leziunea metabolic produs de mutaie sunt suficiente pentru furnizarea precursorilor necesari sintezelor celulare. ile anaplerotice% 0eoarece intermediarii cilor amfibolice sunt n permanen ndeprtai pe de o parte n cursul fazei a treia a catabolismului cu eliberare de energie i pe de alt parte prin utilizarea lor n diferite biosinteze, funcionarea multor cicluri este condiionat de asigurarea unei reaprovizionri permanente cu intermediarii utilizai. 4ceast funcie este asigurat de o serie de ci metabolice au$iliare numite ci anaplerotice. ?le sunt considerate ci suplimentare de producere a intermediarilor metabolici.

&mportana practic a cunoaterii exigenelor nutritive ale microorganismelor

-uncionarea i interaciunile celor > tipuri de ci metabolice au loc n mod perfect coordonat at#t datorit reaciilor comple$e care asigur reglarea activitii lor, c#t i datorit posibilelor adaptri ale microorganismelor la mediile n care triesc. 9unoaterea e$igenelor ( (.

nutritive ale microorganismelor ofer biotehnologului posibilitatea intuirii cilor metabolice ale productorului, precum i posibilitile lui de biosintez a produsului pentru care este cultivat. O cunoatere necorespunztoare a e$igenelor microorganismului productor sau utilizarea n reetele de mediu a unor ingrediente necorespunztoare cerinelor microorganismului poate duce la blocarea sintezei unor substane i deci la scderea randamentului de producie.

!etode i sisteme de cultivare a microorganismelor folosite n biotehnologii

"rin cultivarea unui microorganism se nelege totalitatea operaiilor i lucrrilor prin care se urmrete asigurarea condiiilor de cretere, multiplicare i producere de substane ntr!un sistem tehnologic dat. :etodele de cultivare a microorganismelor sunt foarte diferite i n mare parte dependente de procesul pentru care a fost creat productorul. Orice proces biotehnologic, nainte de a fi elaborat, necesit conceperea unei metodologii de cultivare n cadrul unui sistem de cultivare bine delimitat. !etodologia elaborrii unui sistem de cultivare 0atorit diversitii mari a tipurilor de produse i de metabolii pentru care sunt cultivate microorganismele, stabilirea unei metodologii universal valabile este greu de realizat. "rivit ns n ansamblu i la modul general, metodologia elaborrii unui sistem de cultivare este posibil de realizat. La elaborarea unui sistem de cultivare trebuie s se in seama de o serie de factori5 %. -orma sub care trebuie cultivat microorganismul (la suprafaa mediului sau submers). (. *ipul de microorganism utilizat (aerob sau anaerob). .. 9ondiii de sterilitate (severe sau mai puin severe). >. 9ondiii de multiplicare (culturi continui sau discontinui). O metodologie de cultivare a unui microorganism cuprinde urmtoarele . etape5 %. Obinerea inoculului vegetativ de laborator. (. Obinerea inoculului vegetativ de instalaie n industrie. .. 9ultivarea pe instalaie n vederea obinerii produsului dorit. Obinerea inoculului vegetativ de laborator este etapa n care microorganismul productor este trecut din starea de laten n starea de multiplicare activ, adic trecerea lui pe un mediu care s!i asigure o temperatur optim de dezvoltare. "e parcursul acestei etape se va urmri obinerea unei culturi viabile, viguroase i cu posibiliti de multiplicare rapid. ( (>

Obinerea inoculului vegetativ de instalaie este etapa n care cultura microbian trebuie multiplicat la un raport de %F%) din capacitatea vaselor folosite n proces. "e parcursul acestei etape, procesul trebuie orientat astfel nc#t microorganismul productor s!i dezvolte un potenial corespunztor etapei de producie. 9ultivarea pe instalaie n vederea obinerii produsului dorit este etapa n care microorganismul este trecut n sistemul de producie. 4ici microorganismului trebuie s i se asigure at#t condiii de cretere, dezvoltare, c#t i de producere a produsului de biosintez. 'e cunosc mai multe tipuri de sisteme de cultivare. ?le se clasific dup urmtoarele criterii5 4. 0up modul de desfurare a procesului5 'isteme de cultivare discontinui. 'isteme de cultivare continui. 'isteme de cultivare sincrone.

B. 0up necesitile n aer a microorganismului productor5 'isteme aerobe F agitate. 'isteme anaerobe F staionare.

9. 0up modul n care trebuie cultivat microorganismul5 'isteme de cultivare submerse. 'isteme de cultivare la suprafa.

Sistemele de cultivare discontinui sunt sisteme n care microorganismul productor i parcurge ciclul su de funcionare, dup care procesul trebuie reluat. "e parcursul acestui ciclu se disting mai multe faze specifice unei culturi microbiene. n cadrul acestui sistem de cultivare intervin o serie de factori care limiteaz producia de metabolii. 4stfel, epuizarea substanelor nutritive din mediul de cultur i acumularea de substane to$ice rezultate din metabolism fac ca microorganismul productor s!i diminueze creterea, multiplicarea i producerea de produi utili. ?puizarea substratului din mediul de cultur duce la stagnarea culturii i n final la moartea productorului. Sisteme de cultivare continui% n cadrul acestor sisteme, faza e$ponenial se poate prelungi pe o perioad de timp de zile sau sptm#ni. ntr!un astfel de sistem de cultivare, cultura microbian este permanent alimentat cu substane nutritive, ceea ce face ca procesele de biosintez s se desfoare la valori superioare. ( (/

3n sistem clasic de cultivare continu este cel de tip chemostat. ?ste un sistem de cultivare deschis n care adugarea mediului de cultur proaspt se face la rate de diluie constante, n sistem realiz#ndu!se continuu o amestecare. n cadrul sistemului chemostat rata de introducere a mediului proaspt este egal cu rata de scoatere a unei cantiti din lichidul de cultur ce urmeaz a fi prelucrat. ;nstalaiile de cultivare de tip chemostat sunt relativ simple, dar ele trebuie astfel concepute nc#t s asigure urmtoarele condiii5 9ultura trebuie s fie nchis ntr!un spaiu steril pentru a se evita contaminarea. ' ofere posibiliti de modificare a ratei de diluie, adic s prezinte dispozitive de reglare a cantitii de mediu care urmeaz a fi introdus n sistem. ' ofere posibiliti de meninere a volumului culturii constant. 9ultura s fie suficient de agitat astfel nc#t flu$ul de mediu introdus n cultur s fie dispersat instantaneu i omogen. ' ofere posibiliti de pstrare a o$igenului solvit la un nivel superior fr a se limita creterea i producerea de metabolii. ' ofere posibiliti de reglare a temperaturii n chemostat, a pA!ului culturii, a o$igenului solvit i a 9O( rezultat.

( (E