Adn Rec

Descărcați ca docx, pdf sau txt
Descărcați ca docx, pdf sau txt
Sunteți pe pagina 1din 18

CUPRINS

1. Introducere………………………………………………………………………………..1
2. Aplicatiile tehnologiei ADN
recombinant……………………………………………….4
2.1. Insulina……………………………………………………………………………….6
2.2. Terapia
genica………………………………………………………………………..7
2.3. Producerea de anticorpi si derivate…………………………………………………
8
2.4. Dezvoltarea de vaccinuri si
hormoni………………………………………………..9
2.5. Proteine celulare……………………………………………………………………..9
2.6. Tratamentelul si diagnosticul bolilor infectioase…………………………………
10
2.6.1 Tinte pentru vaccinuri bacteriene
recombinante………………………….10
2.6.2 ADN Recombinant in diagnosticul bolilor
infectioase…………………….12
Concluzii
Bibliografie
INTRODUCERE

Tehnologiile de inginerie genetica au luat amploare in ultimul timp, fiind folosite cu


succes in obtinerea de enzime, hormoni, imunomodulatori sau alte substante necesare in
terapiile de substitutie. Aceste metode au permis obtinerea, prin tehnologia ADN
recombinat, unor cantitati crescute de substanta care, prin metode obisnuite, ar fi fost
extrase cu implicarea unor costuri ridicate si in cantitati insuficiente.

Ce este tehnologia ADN-ului recombinant?


Tehnologia ADN-ului recombinant este îmbinarea moleculelor de ADN de la două
specii diferite. Molecula de ADN recombinat este inserată într-un organism gazdă pentru
a produce noi combinații genetice care sunt de valoare pentru știință, medicină,
agricultură și industrie. Deoarece centrul geneticii este gena, scopul fundamental al
geneticienilor de laborator este izolarea, caracterizarea și manipularea
genelor. Tehnologia ADN-ului recombinant se bazează în principal pe alte două
tehnologii, clonarea și secvențierea ADN-ului. Clonarea se efectuează pentru a obține
clona unei anumite gene sau secvențe de ADN de interes. Următorul pas după clonare
este de a găsi și a izola acea clonă printre alți membri ai bibliotecii (o colecție mare de
clone). Odată ce un segment de ADN a fost clonat, secvența sa de nucleotide poate fi
determinată. Cunoașterea secvenței unui segment ADN are multe utilizări.

Când a fost inventată tehnologia ADN-ului recombinant?


Posibilitatea tehnologiei ADN-ului recombinant a apărut odată cu
descoperirea enzimelor de restricție în 1968 de către microbiologul elvețian Werner
Arber. Anul următor microbiologul american Hamilton O. Smith a purificat așa-numitele
enzime de restricție de tip II, care s-au dovedit a fi esențiale pentru ingineria genetică
pentru capacitatea lor de a cliva la un anumit loc din ADN (spre deosebire de enzimele de
restricție de tip I, care scindează ADN la situri aleatorii). Bazându-se pe munca lui Smith,
biologul molecular american Daniel Nathans a contribuit la avansarea tehnicii
recombinării ADN în 1970–71 și a demonstrat că enzimele de tip II ar putea fi utile în
studiile genetice. Cam în același timp, biochimistul american Paul Berg au dezvoltat
metode de divizare a moleculelor de ADN la locurile selectate și atașarea unor segmente
ale moleculei la ADN-ul unui virus sau plasmidă , care ar putea pătrunde apoi în celule
bacteriene sau animale. În 1973 biochimiștii americani Stanley N. Cohen și Herbert W.
1
Boyer au devenit primii care au introdus gene recombinate în celulele bacteriene, care
apoi s-au reprodus.

Cum este utilă tehnologia ADN-ului recombinant?


Prin tehnici de ADN recombinat, bacteriile au fost create, care sunt capabile să
sintetizeze umane insulină , hormonul de creștere uman , interferon alfa, vaccin hepatitic
B, precum și alte substanțe utile punct de vedere medical. Tehnologia ADN-ului
recombinant poate fi, de asemenea, utilizată pentru terapia genică, în care o genă normală
este introdusă în genomul unui individ pentru a repara o mutație care provoacă o boală
genetică. Capacitatea de a obține clone ADN specifice folosind tehnologia ADN-ului
recombinant a făcut, de asemenea, posibilă adăugarea ADN-ului unui organism la
genomul altuia. Gena adăugată se numește transgenă, care poate fi transmisă
descendenților ca o nouă componentă a genomului. Organismul rezultat care transportă
transgenul se numește organism transgenic sau organism modificat genetic (OMG). În
acest fel se face un „organism de proiectare” care conține unele modificări specifice
necesare pentru un experiment de genetică de bază sau pentru îmbunătățirea unei tulpini
comerciale.

ADN clonarea
În biologie, o clonă este un grup de celule sau organisme individuale descendente de
la un progenitor. Aceasta înseamnă că membrii unei clone sunt identici genetic, deoarece
replicarea celulară produce celule fiice identice de fiecare dată. Utilizarea
cuvântului clonă a fost extinsă la tehnologia ADN recombinant, care a oferit oamenilor de
știință capacitatea de a produce multe copii ale unui singur fragment de ADN, cum ar fi o
genă, creând copii identice care constituie o clonă ADN. În practică, procedura se
realizează prin introducerea unui fragment de ADN într-o moleculă mică de ADN și apoi
permiterea acestei molecule să se replice în interiorul unei celule vii simple, cum ar fi o
bacterie. Micula moleculă de reproducere se numește AND vector (purtător). Vectorii cei
mai des folosiți sunt plasmide (molecule ADN circulare care au provenit
din bacterii ), virusuri și celule de drojdie. Plasmidele nu fac parte din genomul celular
principal, dar pot transporta gene care oferă celulei gazdă proprietăți utile, cum ar
fi rezistența la medicamente , capacitatea de împerechere și producția de toxine. Sunt
suficient de mici pentru a fi manipulate în mod convenabil experimental și, în plus, vor
transporta ADN suplimentar care este îmbinat în ele.
2
Fig.1 Etapele tehnologiei ADN recombinant

3
2. APLICATIILE TEHNOLOGIEI ADN RECOMBINANT

Cum se utilizează tehnologia ADN-ului recombinant în practica medicinei?


Tehnologia ADN-ului recombinant are aplicații în sănătate și nutriție. În medicină,
este utilizat pentru a crea produse farmaceutice precum insulina umană. ... Gena decupată
este apoi introdusă într-o bucată circulară de ADN bacterian numită plasmidă. Plasmida este
apoi reintrodusă într-o celulă bacteriană.
Ce este o aplicație a tehnologiei ADN în medicină?
Tehnologia ADN-ului recombinant le permite oamenilor de știință să dezvolte
vaccinuri prin clonarea genei utilizate pentru proteina antigenă de protecție. Vaccinurile
virale sunt cel mai frecvent dezvoltate prin intermediul acestei tehnologii, de exemplu,
Herpes, Gripă, Hepatită și Boala aftoasă. Hormonul de creștere uman este un hormon
polipeptidic.
Care sunt câteva exemple de tehnologie ADN recombinantă?
Prin tehnici de ADN recombinant, s-au creat bacterii capabile să sintetizeze insulina
umană, hormonul de creștere uman, interferonul alfa, vaccinul împotriva hepatitei B și alte
substanțe utile din punct de vedere medical.
Cum ajută tehnologia ADN-ului recombinant la producerea vaccinurilor?
Un vaccin recombinant este un vaccin produs prin tehnologia ADN-ului recombinant.
Aceasta implică inserarea ADN-ului care codifică un antigen (cum ar fi o proteină bacteriană
de suprafață) care stimulează un răspuns imun în celulele bacteriene sau de mamifere,
exprimând antigenul în aceste celule și apoi purificându-l din ele.
Care sunt aplicațiile tehnologiei ADN recombinant?
Tehnologia ADN-ului recombinant este utilizată pentru a produce microbi, plante și
animale care transportă gene de la alte specii. Tehnologia ADN-ului recombinant poate fi
utilizată în diagnosticul prenatal al bolii genetice umane.
Care sunt etapele tehnologiei ADN-ului recombinant?
Există șase pași implicați în tehnologia ADNr. Acestea sunt - izolarea materialului genetic,
digestia enzimei de restricție, utilizarea PCR pentru amplificare, ligarea moleculelor de ADN,
introducerea ADN-ului recombinant într-o gazdă și izolarea celulelor recombinante.
Unde se găsește ADN recombinant?
ADN-ul recombinant este utilizat pe scară largă în biotehnologie, medicină și
cercetare. Astăzi, proteinele recombinante și alte produse care rezultă din utilizarea
tehnologiei ADN se găsesc, în esență, în fiecare farmacie occidentală, medic sau cabinet
veterinar, laborator de testare medicală și laborator de cercetare biologică.
Este sigur ADN-ul recombinant?

4
Prima și cea mai cunoscută tehnică este ADN-ul recombinant (ADNr). A fost
subiectul unei cercetări și dezvoltări intense în ultimii zece ani și sa dovedit a fi sigur atunci
când este utilizat în laborator. Primele aplicații comerciale au fost aprobate (de exemplu,
insulină umană, fenilalanină, hormon de creștere uman).
Care sunt exemple de ADN?
Un exemplu de ADN este lanțul de materiale de bază din cromozomii celulei umane. În
1953, James D. Watson și Francis Crick au propus ideea că structura ADN-ului era o dublă
spirală. Abia după ce oamenii de știință au folosit tehnologia cu raze X, au reușit să vadă în
cele din urmă structura unei molecule de ADN.

Fig 2. Ilustrarea aplicatiilor tehnologiei ADN recombinant

5
2.1 Insulina
Rolul insulinei in organism
Insulina este un hormon polipeptidic cu mare impact asupra metabolismului,
intervenind chiar in procesele senzoriale si in cele cognitive. In metabolismul glucidic,
insulina asigura cresterea depozitelor de glicogen si scade glicogenoliza hepatica. In
metabolismul proteic favorizeaza sinteza proteinelor in muschi prin usurarea transportului
aminoacizilor si stimularea sintezei ribozomale in celulele musculare. De asemenea,
stimuleaza sinteza trigliceridelor si scade lipoliza prin inhibarea lipazei din adipocite.
In celulele beta-Langerhans din portiunea endocrina a pancreasului (care reprezinta doar 2%
din intreaga masa pancreatica), insulina este sintetizata din precursorul ei, proinsulina, sub
actiunea enzimelor proteolitice, precum prohormon convertaza si carboxipeptidaza.
Insulina este produsa de celulele pancreatice si eliberata sub actiunea a numerosi stimuli.
Eliberarea nu este continua, ci oscileaza (chiar si in cursul digestiei) la 3-6 minute. Astfel,
este impiedicat procesul de down-reglare a receptorilor pentru insulina, fiind facilitata
metabolizarea sa de catre ficat.
In celulele asupra carora actioneaza, insulina transmite un semnal de transductie a carui
consecinta este captarea si stocarea glucozei sub forma de glicogen de catre ficat si muschi.
Cand insulina lipseste sau se gaseste in organism in cantitate scazuta, glucoza nu mai este
consumata. Drept sursa de energie este folosit tesutul adipos. Apare astfel diabetul zaharat tip
I, dependent de aportul exogen de insulina.
Obtinerea insulinei prin recombinare genetica
Obtinerea insulinei cu ajutorul bacteriilor, mai precis prin intermediul Escherichiei
Coli, prezinta, fata de cea obtinuta prin extractie din pancreasul animal, avantajul ca nu
induce retinopatii, nefropatii. Totodata, nu are potential alergen. Are aceleasi proprietati ca si
insulina umana pancreatica, fiind cea mai pura insulina existenta pe piata farmaceutica pana
in prezent.  Mai mult, studiile clinice au aratat ca este mai eficienta decat insulina umana.
Exista in prezent doua procedee de obtinere a insulinei prin tehnologia clonarii genelor.
Primul se bazeaza pe clonarea genelor corespunzatoare celor doua catene ale insulinei,
sintetizate chimic, iar al doilea, pe clonarea ADN complementar corespunzator proinsulinei.
In ambele cazuri, clonarea se face in bacteria E. coli. Toate tehnologiile de biosinteza care
folosesc microorganisme manipulate genetic au probleme cu stabilitatea mutantului, deoarece
toti mutantii sunt instabili, iar dupa un anumit numar de multiplicari revin la forma
parenterala. Problema stabilitatii devine esentiala atunci cand se lucreaza in flux continuu sau
cu volume mari. In cazul utilizarii E. coli, aceasta genereaza 60 de cicluri de viata in care
produce insulina, fiind capabila sa produca 12 000 L de mediu de cultura. (Cristea A. N.,
2008)
Formulari farmaceutice ale insulinei
In terapeutica, insulina se masoara in unitati. O unitate de insulina se defineste ca fiind
cantitatea necesara pentru a scadea glicemia la iepure, pe nemancate, la 45 mg/100mL. Pentru
preparatele purificate, unitatea se raporteaza la greutate. 1 mg de insulina standard contine
24-28 de unitati. Preparatele utilizate in terapeutica au un continut de 40 sau 100 unitati/mL.

6
Formularea farmaceutica a insulinei a prezentat probleme la inceput, din cauza
instabilitatii sub forma de solutie la conservare, pe o perioada mai mare de timp. Molecula de
insulina are o sarcina negativa la pH neutru, iar formulata ca solutie cu pH acid devine
instabila in timp, din cauza unui proces de dezamidare, cu pierderea activitatii biologice.
Deoarece in celulele pancreatice este stocata sub forma de hexameri cu zinc, s-a recurs la
stabilizarea chimica a acesteia prin adaugarea a aproximativ 0,4% zinc si a conservantilor
fenolici.
Formularile normale (simple) neutre, numite INSULINA REGULAR, prezinta o activitate
maxima a insulinei dupa 2-3 ore, cu o durata maxima de 6-8 ore.
INSULINA LISPRO, obtinuta prin schimbarea pozitiilor lizinei si a prolinei din structura
acesteia, prezinta un profil mai rapid de actiune, avand activitate maxima dupa aproximativ o
ora. Au fost concepute si formulari solubile care pot fi utilizate in pompe externe sau
implantate.
O alta formulare farmaceutica a insulinei este insulina cu actiune intermediara,
INSULINA NPH sau INSULINA LENTE. Insulina NPH se gaseste co-cristalizata cu
protamina, proteina cu caracter puternic bazic. Prezinta o stare latenta de 1-2 ore si o durata
de actiune de 18-24 de ore, variind in functie de doza, locul injectarii si temperatura. Insulina
NPH poate fi amestecata ex tempore cu INSULINA REGULAR in raport de 70/30 sau 50/50,
oferind un mai bun control al glicemiei.
INSULINA ULTRALENTE este singura insulina cu actiune prelungita, avand o durata de
actiune de pana la 28 de ore. Insulina recombinata se gaseste pe piata farmaceutica in
flacoane de 10 mL, cu o concentratie standard de 100 unitati/mL. (Chang X et al, 1997)

2.2 Terapia genica


Terapia genica este o tehnica avansata cu potential terapeutic in serviciile medicale.
Primul succes raportat in terapia genica legat de vindecarea unei boli genetice a oferit o mai
mare siguranta legat de eficacitatea vindecarii in general a celor mai mortale boli genetice
(Cavazzana-Calvo M. et al., 2000). Aceasta strategia a prezentat rezultate bune pentru
dezvoltarea tratamentului pentru deficienta de adenozin-deaminaza (ADA-SCID), care
reprezinta o imunodeficienta primara. La inceputul acestei tehnologii, mai multe piedici
precum stabilizarea pacientilor sub terapie cu PEG-ADA (adenozin dezamina modificata cu
polietilen glicol) in timpul terapiei genice si tintirea transferului de gene catre limfocitele T
au constituit cauza rezultatelor nedorite. (S. J. Howe et al., 2008). Mai tarziu, rezultatele
dorite au fost obtinute prin tintirea celulelor stem hematopoetice utilizand un protocol
imbunatatit de transfer al genelor si un regim de condiționare mieloablativă. (A. Aiuti et al.,
2002)
Transferul genelor către un număr mic de celule în locuri discrete din punct de vedere
anatomic este o strategie țintită care are potențialul de a conferi beneficii terapeutice. Acesta
a arătat rezultate impresionante pentru distrofii incurabile autozomal recesive, cum ar fi
orbirea congenitală și amauroza congenitală Leber (LCA). Studiu clinic de terapie genică
elvețiano-germană faza I/II care a avut ca scop tratarea bolii granulomatoase cronice în
aprilie 2006, care a venit cu succes (M. G. Ott et al., 2006). Celulele CD34+ mobilizate
izolate din sângele periferic au fost transduse retroviral și infuzate la pacientii la care două

7
treimi dintre acestia au prezentat beneficii clare de pe urma acestui tratament. După
tratament, inhibarea transgenei ca urmare a metilării promotorului viral a cauzat severitatea
infecției care a dus la moartea pacientului (S. Stein et al., 2010)
Multe tipuri de cancer, inclusiv pulmonare, ginecologice, de piele, urologice,
neurologice, și tumori gastro-intestinale, precum și tumori hematologice maligne și
pediatrice, au fost vizate prin terapia genică. Inserarea genelor supresoare tumorale la
imunoterapie, viroterapia oncolitică și terapia enzimatică dirijată genetic prodrug sunt
strategii diferite care au fost utilizate pentru a trata diferite tipuri de cancer. P53, o genă
frecvent utilizata ca supresor tumoral, este un jucător cheie în eforturile de tratare a
cancerului. În unele dintre strategii, transferul de gene p53 este combinat cu chimioterapie
sau radioterapie. Cele mai importante strategii care au fost folosite până în prezent sunt
vaccinarea cu celule tumorale proiectate pentru a exprima molecule imunostimulatoare,
vaccinarea cu vectori virali recombinanți care codifică antigenele tumorale și vaccinarea cu
celule gazdă proiectate pentru a exprima antigenele tumorale (S. L. Ginn et al., 2013)
Tratamentul bolilor cardiovasculare prin terapie genică este o strategie importantă în
știința sănătății. În domeniul cardiovascular, terapia genică va oferi o nouă cale pentru
angiogeneza terapeutică, protecția miocardică, regenerarea și repararea, prevenirea restenozei
în urma angioplastiei, prevenirea eșecului grefei de by-pass și managementul factorilor de
risc. Mutația în codificarea genelor WASP, o proteină care reglează citosskeletonul, provoacă
sindromul Wiskott-Aldrich (imunodeficiență moștenită). Tratamentul său necesită transplant
de celule stem; in cazul in care donatorii potriviti nu sunt disponibili, tratamentul se
realizeaza prin infuzie de HSPCs autologe modificate ex vivo prin terapie genica. (A. Aiuti et
al., 2013)

2.3 Producerea de anticorpi si derivate

Sistemele vegetale au fost utilizate recent pentru exprimarea și dezvoltarea diferiților


anticorpi și a derivaților acestora. Cel mai important, din mulți anticorpi și derivați de
anticorpi, șapte au ajuns la etapele satisfăcătoare ale cerințelor. Plantele de tutun transgenice
pot fi utilizate pentru producerea secretoarelor himerice IgA/G cunoscute sub numele de
CaroRx, CaroRx. Agentul patogen oral responsabil de cariile unui dinte cunoscut sub numele
de Streptococcus mutants, poate fi recunoscut de acest anticorp. Un anticorp monoclonal
numit T84.66 poate funcționa afectiv pentru a recunoaște antigenul carcinoembrionic, care
este încă considerat un marker caracterizat afectiv în cancerele epiteliului (E. Stöger et al.,
2000). Un IgG1 umanizat de lungime completă, cunoscut sub numele de anti-HSV și anti-
RSV, care poate funcționa ca agent de recunoaștere pentru virusul herpes simplex (HSV)-2-
glicoproteina B, a fost exprimat în soia transgenică și celulele Ovarului de hamster chinezesc
(CHO). Anticorpii din ambele surse s-au dovedit a preveni transmiterea vaginală HSV-2 la
șoareci după aplicarea topic; dacă ar funcționa în mod similar la om, ar fi considerată o
prevenire ieftină și afectivă împotriva bolilor transmise prin interacțiuni sexuale. (C. W.
Adams et al., 2006). 8C13 este un anticorp SCFv bazat pe idiotipul limfocitelor B maligne
din linia celulară a limfomului de șoarece bine caracterizată 38C13. Administrarea
anticorpului la șoareci a dus la producerea de anticorpi anti-idiotip care sunt capabili să
recunoască celulele 38C13, care ajută la protejarea șoarecilor împotriva celulelor limfomului
injectate, este o provocare letală (A. A. McCormick et al., 2008). Enzimele capabile de
recunoastere unor markeri unici ar putea fi produse prin intermediul acestui sistem, cel mai

8
afectiv markeri de suprafață a unei maligne celule B pentru a lucra ca o terapie eficientă
pentru boli precum limfomul non-Hodgkin la om. Un anticorp monoclonal cunoscut sub
numele de PIPP este specific pentru recunoașterea gonadotropinei corionice umane.
Producerea de anticorpi monoclonali de lungime completă și derivați de SCFv și diabody a
fost posibilă în plante prin transgeneză și agroinfiltrare în tutun transformat tranzitoriu (S.
Kathuria et al., 2002). Productia de testosteron prin hCG stimulat poate fi inhibata de fiecare
dintre acesti anticorpi in celulele cultivate de LEYDIG, iar cresterea in greutate uterina ar
putea fi intarziata la soareci, prin care se verifica activitatea hCG. Diagnosticul și terapia
tumorilor pot fi efectuate cu ajutorul anticorpilor.

2.4 Dezvoltarea de vaccinuri si hormoni

Vaccinurile comparativ convenționale au o eficacitate și o specificitate mai scăzute


decât vaccinul recombinant. O tehnică fără teamă și nedureroasă de a transfera vectorii
adenovirusului care codifică antigenele patogene este prin transfer nazal, care este, de
asemenea, o metodă rapidă și de protecție împotriva agenților patogeni mucoase. Acesta
acționează ca un vaccin medicamentos în care o stare anti-gripală poate fi indusă printr-o
expresie transgenă în căile respiratorii (J. Zhang et al., 2011).
Producția in vitro de hormon de stimulare a foliculului uman (FSH) este acum
posibilă prin tehnologia ADN-ului recombinant. FSH este considerabil o proteină
heterodimerică complexă și linia celulară specificată din eucariote a fost selectată pentru
expresia sa. Tratamentul reproducerii asistate prin stimularea dezvoltării foliculare este o
realizare a tehnologiei ADN-ului recombinant. Un număr mare de pacienți sunt tratați prin r-
FSH. Cel mai interesant r-FSH și hormon luteinizant (LH) recombinare a fost făcută de
succes pentru a spori ovulația și sarcina. (Q. R. Fan si W. A. Hendrickson, 2005)

2.5 Proteine celulare


Un alt grup de produse produse în mare cantitățile prin tehnologia ADN-ului
recombinant sunt clasa generală de proteine cel mai bine descrisă de termenul de efectori
celulari. Acestea includ thymosin alfa-1, interferonii și hibrizii lor și, mai recent, perspectiva
de a produce numeroase alte limfookine important pentru modularea răspunsului imun, cum
ar fi ca interleukina-2. (Taniguchi T. et al., 1983)
Interferonii au atras cea mai mare cantitate de atenție. Sunt glicoproteine mici, stabile
termic, care au atât activități antivirale, cât și antitumorale. Când interferonii sunt produși în
bacterii, ei nu sunt glicozilați, ci par să-și păstreze activitatea biologică. Rezultatele studiilor
clinice inițiale cu interferon ADN recombinant ca agent antiviral au fost încurajatoare în ceea
ce privește tratamentul profilactic al infecțiilor cu rinovirus și eficacitatea în hepatită; cazurile
de infecție cu herpes sunt, de asemenea, în curs de examinare. (Merigan TC, 1982). Deși
activitatea antivirală a interferonilor se poate dovedi cea mai valoroasa din punct de vedere
clinic, ele sunt, de asemenea, în curs de examinare pentru activitatea antitumorale. În primul
raport privind un studiu multidoză de fază I a alfa-interferonului leucocitar de la E coli, 81 de
pacienți cu diverse leziuni maligne diseminate refractare au primit injecții cu cantități tot mai
mari de la 1 la 136 de milioane de unități pe injecție. Reacțiile toxice au fost similare cu cele

9
observate cu febră interferon nonrecombinantă, frisoane, anorexie, greață, vărsături,
leucopenie reversibilă dependentă de doză și creșteri serice ale aminotransferazei. (Sherwin
SA et al., 1982). Dovezile obiective ale activității antitumorale au fost observate la un procent
mic de pacienți cu regresie tumorală și remisiuni de până la șapte luni, indicând faptul că
produsul proiectat genetic este biologic activ. Acest lucru tinde să fie de acord cu studiile de
fază I mai mici pentru tratamentul osteosarcomului și sarcomului Kaposi. Evaluarea
definitivă a eficacității clinice a acestui interferon și a altor interferoni va aștepta rezultatele
studiilor de fază II în curs de desfășurare. Studiile citoreductive de fază II în neoplasme
maligne specifice sunt în curs de desfășurare pentru a determina frecvența și durata
răspunsului cu o doză zilnică maximă tolerată. Interferonii clonati vor fi probabil evaluati in
multe situatii in care nu exista terapie si s-a observat o cauza virala sau tulburari
imunologice, cum ar fi in cazurile de scleroza multipla si scleroza laterala amiotrofica sau
chiar anumite forme de artrita.
Când ne uităm la contribuția tehnologiei de clonare a ADN-ului la cercetarea
medicală pe interferoni, la alți modificatori de răspuns biologic și la aceste diverse alte
produse proteice, toate domeniile medicinei sunt cu siguranță profund influențate de această
nouă tehnologie în evoluție.

2.6. Tratamentelul si diagnosticul bolilor infectioase

2.6.1. Tinte pentru vaccinuri bacteriene recombinante


Progresele în terapia antimicrobiană realizate în ultimele trei decenii au devenit
centrul practic al domeniului bolilor infecțioase clinice. În aceleași trei decenii care au urmat
descoperirii structurii duble elicoidale a ADN-ului, progresele în înțelegerea noastră de bază
a geneticii microbiene au condus la crearea ingineriei genetice. Deși tehnologia ADN-ului
recombinant poate crește eficacitatea agenților antimicrobieni care produc industrial, ea va fi
esențială pentru următoarele revoluții în tratamentul bolilor infecțioase clinice: noi vaccinuri
subunități și instrumente de diagnosticare rapidă. În această recenzie îmi voi limita discuția la
impactul probabil al tehnologiei ADN recombinant asupra prevenirii și diagnosticării bolilor
bacteriene. Considerații similare ar trebui să fie relevante pentru bolile virale, fungice și
parazitare. (Stephen D. Cederbaum et al., 1984)

Impedimentul pentru utilizarea produselor ADN recombinant în tratarea bolilor


infecțioase apare din problemele inerente utilizării componentelor native ale agenților
patogeni în testele de diagnosticare sau vaccinuri. Bacteriile pot fi dificil, sau chiar imposibil,
de cultivat in vitro (cum ar fi Mycobacterium leprae, Treponema pallidum); creșterea unor
volume mari de agenți patogeni umani (cum ar fi rickettsiae) poate fi periculoasă; purificarea
substanțelor microbiene poate fi dificilă, iar producerea unei substanțe dorite de către un
agent patogen poate fi nesigură. Contaminarea cu substanțe nedorite derivate din patogeni
este întotdeauna o preocupare. Tehnologia actuală a ADN-ului recombinant poate depăși
toate problemele asociate cu substanțele derivate din patogeni. Amplificarea genei și
îmbunătățirea expresiei genei în E coli sau alte gazde bacteriene pot determina ca produsul
genei patogenului să cuprindă o fracțiune substanțială din masa celulei gazdă, facilitând
foarte mult purificarea și asigurând o producție stabilă. Este mai sigur să lucrați cu produse
genetice patogene individuale în E coli K12, în cele mai multe cazuri, decât cu bacteria
patogenă nativă.

10
Țintele probabile pentru vaccinurile bacteriene recombinate sunt enumerate în Tabelul
1. Primul grup sunt mai multe varietăți de proteine de suprafață bacteriene, printre care pili.
Pilii bacterieni sunt anexe filamentoase, localizate la suprafață, care sunt polimeri ai
subunităților polipeptidice. Pili sunt foarte evoluați pentru a media atașarea bacteriilor la
receptorii de pe țesuturi umane specifice. În anumite boli bacteriene, prezența unui atașament
special mediat de pilus la un țesut țintă este critică pentru virulența organismului. (Evans DG
et al., 1975)
Pentru a aprecia potențialul ADN-ului recombinant de a produce pili pentru
imunizarea umană, trebuie mai întâi să luăm în considerare munca importantă cu animale.
K88 și K99 sunt denumiri pentru pili care mediază atașarea E coli enterotoxică la intestinul
subțire al porcilor și bovinelor, provocând diaree severă. Genele pentru pili au fost donate și
exprimate în E coli K12. Exprimarea genelor donate a fost optimizată și purificate vaccinurile
subunității K88 și K99 previn diareea la animale (S. Falkow, PhD, comunicare verbală,
1982). Această activitate este incitantă din mai multe motive: reprezintă prima utilizare cu
succes a unui vaccin ADN recombinant pentru a controla o boală bacteriană. De asemenea,
arată în mod dramatic că vaccinarea parenterală cu un vaccin subunitar poate duce la o
imunitate eficientă la suprafața mucoasei.
Tulpinile de E coli enterotoxice care provoacă „diareea călătorilor” posedă pili
speciale, denumite CFA I și CFA II (pentru antigenele factorului de colonizare), care sunt
factori critici de virulență care mediază atașarea la mucoasa intestinului subțire uman. CFA I
și CFA II sunt, prin urmare, analogii K88 și K99 pentru boala umană. Este rezonabil să
sperăm că se pot crea vaccinuri subunități recombinate eficiente bazate pe CFA I și II.
Tulpinile bacteriene care cauzează pielonefrita au pili speciali, numiti P pili, care se
leagă de receptorii specifici ai celulelor uroepiteliale. Acești P pili au fost clonați (G.
Schoolnik, MD și S. Falkow, PhD, comunicare verbală, 1982) și ar trebui să fie fezabil să se
afle dacă P pili poate forma sau nu baza unui vaccin uman pentru pielonefrită.
Alte proteine de suprafață în plus față de pili sunt luate în considerare ca candidate
pentru vaccinuri experimentale. Proteina membranei exterioare a meningococilor de grup B,
Hemophilus influenzae de tip b și streptococilor de grup B vor fi studiate ca adjuvanti sau
alternative la polizaharidele capsulare. Proteinele membranei exterioare gonococice și
chlamidiale pot contribui, de asemenea, la imunitatea protectoare.
Al doilea grup de candidați pentru antigeni modificați pentru a servi ca vaccinuri
antibacteriene sunt factorii de virulență și toxinele. Neisseria și H influenzae patogene produc
o protează IgA al cărei rol în boală a fost neclar. Genele pentru aceste proteaze au fost donate
și exprimate în E coli și au fost stabilite sisteme genetice pentru reintroducerea lor în speciile
de origine (S. Falkow, PhD, comunicare verbală, 1982). Manipularea genetică a genelor de
protează IgA ar trebui să faciliteze înțelegerea rolului lor în patogeneza bolii.

11
Exotoxinele bacteriene reprezintă un alt domeniu în care tehnologia ADN-ului
recombinant a avut un impact atât în înțelegerea mecanismului patogen de bază, cât și prin
oferirea potențialului de vaccinare. Gena pentru toxina termolabilă a E coli enterotoxică a fost
donată și secvențializată (Dallas WS et al., 1980). Au fost definite genele care specifică
atașarea și activitatea toxică, permițând construirea unui vaccin compus doar din subunitatea
de legare.
Candidații finali pentru vaccin pe care îi voi descrie sunt polizaharidele capsulare.
Antigenul capsular E coli Ki, care este imunochimic identic cu capsula meningococului de
grup B, este asociat cu multe tulpini de E coli care cauzează meningită. Folosind donarea
cosmidelor, Silver și asociații au transferat gena (genele) care specifică biosinteza K1 la
tulpini de laborator E coli K12 neîncapsulate. Aceasta reprezintă prima utilizare a ADN-ului
recombinant pentru a studia polizaharidele capsulare. (Silver RP et al., 1981)
Sintetizarea polizaharidei de suprafață celulară din specii bacteriene patogene poate fi
importantă din mai multe motive. Producția stabilă și abundentă de antigen poate fi realizată
fără dificultatea sau potențialul pericol biologic inerent în cultivarea unor volume mari de
patogen exigent sau necultivabil. Există, de asemenea, potențialul de a modifica genetic
enzimele implicate în sinteza polizaharidelor, astfel încât să poată fi creați polimeri cu
compoziție și antigenicitate modificate.

2.6.2. ADN recombinant in diagnosticul bolilor infectioase

Folosind gene clonate pentru enterotoxina E coli termolabila, Moseley si colab.(1982)


au aratat ca hibridizarea ADN-ului este un instrument puternic pentru a detecta prezenta unui
agent patogen direct in specimenele clinice. Au fost construite „sonde ADN” care detectează
Chlamydia trachomatis, N gonorrhoeae și o varietate de agenți patogeni enterici (S. Falkow,
PhD, comunicare verbală, 1982). Hibridizarea ADN-ului a fost folosită pentru a detecta
ADN-ul cytomegalovirusului în urină.
Deoarece anumite gene care codifică rezistența antimicrobiană pot fi clonate cu
ușurință, sondele ADN vor identifica probabil un agent patogen și, de asemenea, vor arăta
rezistența sa antimicrobiană. Sondele ADN ar putea fi, de asemenea, utilizate ca un adjuvant
de diagnostic rapid la culturile de țesuturi sau tehnicile convenționale de cultură bacteriană.
Înainte ca sondele ADN să poată fi utilizate în mod obișnuit în laboratoarele de microbiologie
clinică, totuși, trebuie dezvoltate metode de etichetare a ADN-ului pentru a evita utilizarea
radioizotopilor. Hibridizarea în sine se poate face în mai puțin de trei ore.
Tehnologia ADN-ului recombinant poate furniza cantități mari de antigeni microbieni
puri pentru serotestare precisă și reproductibilă. Antigenele donate pot fi utilizate direct în
serotestele; acestea ar putea fi utilizate și în testele pe bază de anticorpi monoclonali. Un
antigen T pallidum sintetizat în E coli a fost un antigen serodiagnostic mai bun pentru
diagnosticarea sifilisului decât testele convenționale și treponemale (MA Lovett, MD, PhD,
1983).

12
13
Concluzii

Am trecut în revistă unele dintre principiile de bază ale tehnologiei ADN recombinant
și unele domenii cu impact existent sau iminent asupra medicinei clinice. Se crede că
adevăratul potențial al acestei tehnologii tocmai a început să fie exploatat și că este
rezonabil să anticipăm progrese majore în următorii câțiva ani. Aceste progrese vor fi
resimțite în producția de produse biologice și medicamente noi și mai utile; în dezvoltarea
de sonde care oferă o înțelegere mai profundă a funcției normale, inclusiv cea a
dezvoltării sistemului imunitar; în înțelegerea expresiei genelor în dezvoltarea și
maturarea embriologică și în existența, natura și controlul „oncogenelor” care pot juca un
rol în cancer. În cele din urmă, genele clonate sau ADN-ul lor complementar vor fi
introduse și exprimate în celule străine într-un mod previzibil și reproductibil și vor servi
drept bază pentru terapia genică. Se consideră că implicarea tehnologiei ADN
recombinant va crește în fruntea medicinei.

14
BIBLIOGRAFIE

1. ADN recombinant | Definiție, pași, exemple și invenție (delphipages.live) ;


2. DifferBetween | tehnologie ADN recombinantă în medicină ;
3. westjmed00180-0064.pdf (nih.gov)
4. Cristea A. N., Tratat de farmacologie, Editura Medicala, 2008;
5. Note de curs, Biotehnologii si industrie farmaceutica;
6. Chang X., Jorgensen A. M., Bardrum P., Led J. J. (August 1997), Solution
structures of the R6 human insulin hexamer, Biochemistry 36(31);
7. M. Cavazzana-Calvo, S. Hacein-Bey, G. De Saint Basile et al., “Gene therapy of
human severe combined immunodeficiency (SCID)-X1 disease,” Science, vol.
288, no. 5466, pp. 669–672, 2000;
8. S. J. Howe, M. R. Mansour, K. Schwarzwaelder et al., “Insertional mutagenesis
combined with acquired somatic mutations causes leukemogenesis following
gene therapy of SCID-X1 patients,” Journal of Clinical Investigation, vol. 118,
no. 9, pp. 3143–3150, 2008;
9. A. Aiuti, S. Vai, A. Mortellaro et al., “Immune reconstitution in ADA-SCID
after PBL gene therapy and discontinuation of enzyme replacement,” Nature
Medicine, vol. 8, no. 5, pp. 423–425, 2002.
10. M. G. Ott, M. Schmidt, K. Schwarzwaelder et al., “Correction of X-linked
chronic granulomatous disease by gene therapy, augmented by insertional
activation of MDS1-EVI1, PRDM16 or SETBP1,” Nature Medicine, vol. 12, no.
4, pp. 401–409, 2006.
11. S. Stein, M. G. Ott, S. Schultze-Strasser et al., “Genomic instability and
myelodysplasia with monosomy 7 consequent to EVI1 activation after gene
therapy for chronic granulomatous disease,” Nature Medicine, vol. 16, no. 2, pp.
198–204, 2010.
12. S. L. Ginn, I. E. Alexander, M. L. Edelstein, M. R. Abedi, and J. Wixon, “Gene
therapy clinical trials worldwide to 2012—an update,” Journal of Gene
Medicine, vol. 15, no. 2, pp. 65–77, 2013.
13. A. Aiuti, L. Biasco, S. Scaramuzza et al., “Lentiviral hematopoietic stem cell
gene therapy in patients with Wiskott-Aldrich syndrome,” Science, vol. 341, no.
6148, Article ID 1233151, 2013.
14. E. Stöger, C. Vaquero, E. Torres et al., “Cereal crops as viable production and
storage systems for pharmaceutical scFv antibodies,” Plant Molecular Biology,
vol. 42, no. 4, pp. 583–590, 2000.
15. C. W. Adams, D. E. Allison, K. Flagella et al., “Humanization of a recombinant
monoclonal antibody to produce a therapeutic HER dimerization inhibitor,
pertuzumab,” Cancer Immunology, Immunotherapy, vol. 55, no. 6, pp. 717–727,
2006.
16. A. A. McCormick, S. Reddy, S. J. Reinl et al., “Plant-produced idiotype
vaccines for the treatment of non-Hodgkin's lymphoma: safety and
immunogenicity in a phase I clinical study,” Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America, vol. 105, no. 29, pp.
10131–10136, 2008.
17. European Commission, Restrictions of geographical scope of GMO
applications/authorisations: Member States demands and outcomes, 2015
18. S. Kathuria, R. Sriraman, R. Nath et al., “Efficacy of plant-produced
recombinant antibodies against HCG,” Human Reproduction, vol. 17, no. 8, pp.
2054–2061, 2002.
19. J. Zhang, E. B. Tarbet, H. Toro, and D.-C. C. Tang, “Adenovirus-vectored drug-
vaccine duo as a potential driver for conferring mass protection against
infectious diseases,” Expert Review of Vaccines, vol. 10, no. 11, pp. 1539–1552,
2011.
20. Q. R. Fan and W. A. Hendrickson, “Structure of human follicle-stimulating
hormone in complex with its receptor,” Nature, vol. 433, no. 7023, pp. 269–277,
2005.
21. Taniguchi T, Matsui H, Fujita T, et al: Structure and expression of a cloned
cDNA for human interleukin-2. Nature 1983; 302:305-310
22. Merigan TC: Interferon-The first quarter century. JAMA 1982 Nov; 248:2513-
2516
23. Sherwin SA, Knost JA, Fein S, et al: A multiple-dose phase I trial of
recombinant leukocyte A interferon in cancer patients. JAMA 1982 Nov;
248:2461-2466
24. Evans DG, Silver RP, Evans DJ Jr, et al: Plasmid-controlled colonization factor
associated with virulence in Escherichia coli enterotoxigenic for humans. Infect
Immun 1975 Sep; 12:656-667
25. Dallas WS, Falkow S: Amino acid sequence homology between cholera toxin
and Escherichia coli heat-labile toxin. Nature 1980; 288: 499-501
26. Silver RP, Finn CW, Vann WF: Moleoular cloning of the K1 capsular
polysaccharide gene of E coli. Nature 1981; 289:696-698
27. Moseley SL, Echeverria P, Seriwatana J: Identification of enterotoxigenic
Escherichia coli by colony hybridization using three enterotoxin gene probes. J
Infect Dis 1982; 145:863-869

S-ar putea să vă placă și