PLANUL CURSULUI

 ELECTROFOREZA

 METODE SPECTROMETRICE
 Spectrometria UV-VIS
 Turbidimetria si nefelometria

1
 ELECTROFOREZA
Definitie:

 este o metodă care are la bază migrarea particulelor

încãrcate electric, solubilizate sau dispersate într-o soluţie
de electrolit sau printr-un suport solid poros (hârtie
cromatografică, gel) sub acţiunea unui câmp electric.

+ -

+ -2
 Clasificare:
 aplicată ionilor relativ mici se numeşte ionoforeză
 aplicata pentru particule coloidale, micele şi unele macromolecule poartă
termenul de electroforeză.

Se pot separa:
 compuşi metalici
 complecşi cationici şi anionici
 ioni proveniţi din electroliţi slabi (acizi carboxilici, baze organice, molecule
organice amfotere)

Low pH High pH Ex: aminoacizii - funcţie de pH, pot avea

sarcină pozitivă sau negativă.
La punctul izoelectric sau izoionic nu
+ migrează, activitatea electroforetică este nulă.
-H

3
 Migrarea particulelor încărcate, în câmp electric, se face cu o viteză
caracteristică fiecărei specii. Viteza de deplasare poartă numele de
“mobilitate electroforetică”().

Mobilitatea  a unei particule reprezintã distanţa d (în metri) parcursã

de o particulã coloidalã încãrcatã electric în timpul t de o secundã sub
acţiunea unui câmp electric al cãrui gradient de potenţial E este de un
volt/metru.

Se exprimă în m/sec, iar în câmp electric în m2/volt/sec (m2.V-1s-1).

 Gradientul de potenţial este determinat de intensitatea i a
curentului (în amperi) raportatã la conductibilitatea specificã  a
soluţiei şi aria secţiunii A a electrodului:

4
Vâscozitatea mediului influenţează viteza de deplasare a
particulei:

unde:
E = câmpul electric
Q = sarcina particulei
r = raza particulei
 = vâscozitatea.

Atunci, mobilitatea particulei va fi:

5
Clasificarea metodelor electroforetice

După modul cum se desfăşoară electromigrarea:

• electroforeză în mediu liber în coloană de lichid sau
electroforeză cu front mobil (electroforeză frontală,
electroforeză de frontieră)

• electroforeză pe medii stabilizante sau electroforeză

zonală sau pe suport.

6
 Electroforeza în mediu liber
Migrarea electroforetică se realizează în coloană de lichid într-o
celulă formată dintr-un tub în formă de U umplut cu soluţie tampon
de electrolit, cu o secţiune pătrată, construit din sticlă transparentă
si un spectrometru.
Cei doi electrozi se leagă la o sursă de curent continuu şi se aplică o
diferenţă de potenţial de 100-150 volţi.

 Cei trei componenţi proteici vor migra cu viteze diferite ce depind de

mărimea, forma şi sarcina lor.
7
Electroforeza zonala

Se desfãşoarã pe suporturi solide care evitã labilitatea

fronturilor şi eliminã suprafeţele de separare false
datorate concentraţiei soluţiilor.
Lichidul se găseşte într-un suport sau mediu poros:
 hârtie de filtru specială pentru electroforeză - acetat de
celuloză sub formă de folii pentru separarea de insulină,
proteine, lipoproteine, glicoproteine, hemoglobine 
 geluri de agaroză (proteine), agar (proteine, vitamine,
carbohidraţi), poliacrilamidă, silice, răşini schimbătoare
de ioni, amidon (enzime) etc. – au mare putere de
rezoluţie şi de selecţie moleculară.

Aparatul conţine:
• generator de curent continuu cu tensiune
variabilã cuprinsã între 0 şi 250-500 V şi cu
o intensitate de cel mult 50 mA
• camerã de electroforezã cu douã
compartimente separate anodic şi catodic în
care se aflã doi electrozi de platinã şi în care
se poate pune soluţia de electrolit; electrozii
sunt legaţi la bornele generatorului
• densitometru prevãzut cu un înregistrator
de absorbanţã şi un integrator. 8
Metoda de analiză pe hârtie constă în:
proba de analizat se aplică pe banda de hârtie îmbibatã cu soluţie
tampon: tampon barbital pH = 8,6, tampon borat pH = 8,6 şi 9,0,
tampon fosfat pH = 6,3; 6,5; 7,0; 7,5, tampon ftalat pH = 5,9,
tampon acetat pH = 5,6; 4,0, tampon tris-glicină pH = 8,3
Fracţionarea are loc sub influenţa tensiunii aplicate la capetele
benzii.
Identificarea compuşilor separaţi se poate face prin:
- densitometrie
- culoare
- reacţii chimice cu reactivi adecvaţi
- absorbanţă
- fluorescenţă

Mobilitatea electroforetică în cazul analizei pe hârtie este:

unde:
fc = factor de corecţie ce depinde de tipul de hârtie utilizat.

9
Factorii care influenţează electroforeza
1. Natura moleculelor separate
 mărimea particulelor
 natura şi sarcina speciilor.

2. Aparatura
 Suportul

3. Curentul electric
 Deplasarea electroforetică este proporţională cu mobilitatea, câmpul electric şi cu
timpul de trecere al curentului electric → d = .E.t

4. pH-ul
 Nu influenţează electroforeza acizilor, bazelor tari şi a sărurilor.
 Compuşii organici de tipul acizilor carboxilici, bazelor aminate si substanţelor
amfotere migrează numai dacă pH-ul soluţiei de electroliţi este diferit de punctul
izoionic.

5. Natura soluţiei
Ỉn soluţie se pot găsi săruri, acizi, baze etc. care influenţează mobilitatea:
 EDTA, acidul citric favorizează separarea unor ioni anorganici
 Lauril sulfatul de sodiu (LSS) şi dodecilsulfatul de sodiu (DSS) desfac agregatele
prin fixarea de proteine cărora le conferă sarcină negativă.

10
Electroforeza capilară (EC)
Migrarea se face în tub capilar de silice topită, umplut cu o fază ce constituie
mediul de migrare (electroliţi tampon, gel). Capetele capilarelor se introduc în două
bacuri conţinând o soluţie apoasă de electrolit. Diferenţele de potenţial de circa 30
kV sunt furnizate de o sursă de alimentare. Electrozii din platină se introduc în
cele două bacuri. La un pH>3, peretele capilarei de silice se încarcă negativ
determinând acumularea de sarcini pozitive la suprafaţa electrolitului. Se formează
un flux electroosmotic în direcţia catodului.

11
Mediul de migrare: electroliţi tampon sau gel impregnat cu o
asemenea soluţie. Soluţiei i se pot adăuga:
solvenţi organici: acetonitril
agenţi tensioactivi: LSS, DSS
ciclodextrine
agenţi complexanţi, chelatizanţi sau sechestranţi
compuşi ionici ce conţin cromofori, fluorofori.

Migrarea particulelor:
Toţi compuşii încărcaţi electric se deplasează în electrolit cu o viteză
care depinde de mobilitatea lor electroforetică şi de condiţiile
experimentale.
Un alt factor care controlează migrarea soluţilor este curgerea
electrolitului numit flux electro-osmotic caracterizat prin mobilitate
electro-osmotică. Acest flux se află la originea deplasării tuturor
speciilor prezente într-o probă şi depinde de natura peretelui intern
al tubului capilar: negativ provoacă un flux electro-osmotic dirijat
spre catod şi invers; o suprafaţă pozitivă provoacă o dirijare a
acestuia spre anod.

12
 Tehnicile electroforezei capilare

1. Electroforeza capilară zonală

•Este o electroforeză în soluţie liberă şi se realizează într-o capilară
umplută cu soluţie de electrolit. Separarea se face în funcţie de
mobilitatea electroforetică a analiţilor +/- flux electro-osmotic.

EOF
+ -

tm (min) 0
13
2. Electroforeza capilară micelară (MECE)

• Se mai numeşte Electroforeza in solutie micelara sau

cromatografie capilara electrocinetica (Micellar
Electrokinetic Capilary Chromatograpy” (MECC).

• În soluţia de electrolit se adaugă agent tensioactiv.

Se formează agregate sferice purtătoare de sarcini
electrice. Micelele sunt formate din lanţuri, cu
extremităţile hidrofobe spre interior, iar extremităţile
hidrofile încărcate electric orientate spre exterior.
Micelele se dezagregă şi se refac continuu. Ele
înglobează analiţi hidrofobi pe care îi antrenează în
migrarea lor electroforetică.

+ EOF
-
14
 3. Electroforeza capilară pe gel (GCE)

• Solutia de electroliti este imobilizat intr-un gel (gel de agaroză 0,5 – 2 %,

gel de poliacrilamidă 3,5 – 20 %)

• Are loc o filtrare electroforetica selectiva si fractionata - separare prin

“cernerea “ analitilor in functie de masa moleculara

• Ex: separare acizi nucleice, proteine pe gel de poliacrilamida

+ -
Ep
15
4. Electroforeza capilară în contracurent

Utilizata pentru separarea enantiomerilor

Se introduce în soluţia tampon folosită, a unor aditivi numiţi “selectori
chiralici”: ciclodextrine, eteri coroană, proteine, hidraţi de carbon, antibiotice
macrociclice (vancomicina, rifampicine), complecşi metalici enantioselectivi.
Ciclodextrine [CD]: (, , -CD)
Eteri coroană: (+)-(18-crown-6)2,3,11,12-tetracarboxilic acid (18C 6H4), (-)-
(18-crown-6)2,3,11,12-tetracarboxilic acid (18C 6H4)

• Ex: triptofan (L,D), 5-hidroxitriptofan (L,D), fenilalanina (L,D), tirozină (L,D),

homofenilalanina (L,D), 3,4-dihidroxifenilalanina (L,D), 3-
hidroxifenilglicina(L,D).

16
 APLICAŢIILE ELECTROFOREZEI

1. Determinarea mobilităţii electroforetice

2. Separarea electroforetică a chiralilor

Izomerii D şi L pot fi separaţi cu ajutorul ciclodextrinelor, izomerul D formează un
complex stabil cu ciclodextrina si este reţinut mai mult timp de ciclodextrine.

3. Identificarea şi separarea unor compuşi biologici

Chimiotripsina poate fi impurificată cu tripsină şi din acest motiv farmacopeele cer
controlul purităţii prin electroforeza clasică.
Tehnica de lucru prevede:
 folosirea hârtiei de tip MN 862 Whatman nr. 1 sau Schleicher-Schüll 2043 b sub
formă de benzi de 3 cm lăţime.
 benzile de hârtie se impregnează cu tampon barbital pH 8.6 şi se introduc în
camera electroforetică cu aproximativ 15 minute înainte de aplicarea soluţiilor
 se lucrează în paralel, probă şi etalon
 determinarea se efectuează la tensiunea de 200 V timp de 5 ore.
 benzile de hârtie se usucă la temperatura camerei apoi se imersează în reactivul de
colorare constituit din albastru de bromfenol dizolvat în alcool saturat cu clorură
de mercur (II).
 in continuare, benzile de hârtie se spală, de repetate ori în acid acetic 0.5 % până
când fondul benzii de hârtie se decolorează, se usucă parţial la temperatura
camerei şi se expun la vapori de amoniac concentrat.
 proba de analizat se consideră corespunzătoare dacă prezintă o singură zonă
colorată în albastru, iar migrarea s-a făcut cu aceeaşi viteză cu cea a etalonului.
17
Determinarea cantitativă

Fracţiunile separate electroforetic se pot evalua cantitativ prin două

procedee:
în mod direct prin determinarea densităţii optice a spoturilor de pe suport
cu ajutorul spectrometrelor ce pot măsura lumina transmisă (fotometrie prin
transparenţă) sau lumina reflectată (fotometrie prin reflexie)
în mod indirect prin determinarea printr-o metodă ulterioară a fracţiunilor
eluate de pe suport.

IMUNOELECTROFOREZA

 În masa de geloză, într-o adâncitură se pune serul de analizat, iar într-un

şanţ central se introduce serul unui animal imunizat cu antigene.
 In prima etapă, în primul godeu se introduce serul bolnav, iar în al doilea
serul etalon, apoi se face separarea electroforetică.
 Serul imunizat se pune în şanţul central, se lasă în repaus 24 de ore, timp
în care se produce difuzia în geloză a proteinelor separate din serurile
iniţiale şi proteinele serului imunizat.
 La contactul anticorpilor din serul imunizat cu proteinele serice antigene,
acestea din urmă formează arcuri caracteristice de precipitare.
 Prezenţa sau absenţa proteinelor anormale se stabileşte prin compararea
arcurilor formate de serul bolnavului cu cel al martorului.

18
 METODE SPECTRALE ỈN ANALIZA
MEDICAMENTELOR

 SPECTROMETRIA UV-VIS
 TURBIDIMETRIA, NEFELOMETRIA
 SPECTROMETRIA DE FLUORESCENŢA
 SPECTROMETRIA DE FOSFORESCENŢA
 CHEMILUMINISCENŢA Radiatie reflectata
 SPECTROMETRIA IR, FT-IR, NIR
 SPECTROMETRIA RAMAN Absorbtie

 SPECTROMETRIA ATOMICĂ
Radiatie incidenta Proba Radiatie transmisa
 SPECTROMETRIA CU RAZE X
 SPECTROMETRIA RES
 SPECTROMETRIA DE MASĂ
 SPECTROMETRIA RMN
Radiatie imprastiata Radiatie emisa
19
PRINCIPII GENERALE
 Spectrometria = metode bazate pe măsurarea absorbţiei sau emisiei de
energie de catre substanţe în funcţie de lungimea de undă a radiaţiei.

 Metoda se caracterizează prin:

 sensibilitate
 simplitate
 rapiditate
 specificitate.
Spectrul electromagnetic al luminii albe = totalitatea regiunilor spectrale
(UV, VIS, IR, etc).

20 20
Diagrama spectrului electromagnetic al luminii 21
  Radiaţiile electromagnetice se
caracterizează prin:
 lungimea de undă
 frecvenţa
 numărul de undă

unde:
 = lungimea de undă (distanta in linie dreapta dintre doua maxime
consecutive ale unei unde elecromagnetice)
1 Å = 10-8 cm = 10-1 nm = 10-10 m
1 nm = 10-9 m =10-7 cm = 10 Å
1 m = 10-9 m = 10-6 mm
1  = 10-6 m = 10-3 mm

-  = frecvenţa = c/ (numărul de ondulaţii pe unitate de timp; se poate

exprima prin timp-1, sec-1 (unitatea uzuală) sau herţi (Hz)
- c = viteza luminii = 3.1010 cm/sec
- = număr de undă

22
 Fiecare radiatie luminoasa poarta o energie - cuanta de energie -
proportionala cu frecventa acesteia.

E = h = h.c/

- h = constanta lui Planck = 6.6 x 10-27erg sec

Relaţia energie,
frecvenţă şi lungimea
de undă a radiaţiilor

 creşterea lungimii de undă are loc de la razele gama la undele TV-radio

 energia şi frecvenţa radiaţiilor cresc de la undele TV-radio la razele
gamma
 creşterea lungimii de undă se manifestă prin scăderea energiei şi
frecvenţei.
23
 Spectrele de absorbtie se obtin la trecerea unui fascicol de radiatii continue
prin substanta de analizat care poate absorbi o parte din energia acestuia.

 Cantitatea de energie absorbita este functie de:

 structura
 numarul de molecule sau atomi ai substantei cu care interactioneaza fascicolul
de radiatii.

 Energia oricărei molecule este dată de suma energiilor electronice, vibraţionale şi

rotaţionale:
E = Eelectronică + Evibratională + Erotatională
 
 Raportul celor trei energii este:
 Eelectronică > Evibratională > Erotatională

Diagramele nivelelor de energie a moleculelor 24

• Spectrele de emisie se obtin cand substanta de analizat absoarbe
energie, trece in stare excitata, iar revenirea in stare fundamentala
se produce prin emisia unei radiaţii.

25
 Spectrele de absorbţie se obţin la trecerea unei radiaţii continue
provenite de la o sursă luminoasă prin substanţa de cercetat, care
absoarbe din spectru linii sau benzi.

 Absorbţia radiaţiilor luminoase în condiţiile analizei spectrale

cantitative are loc conform legii Lambert-Beer.

 La trecerea unei radiaţii luminoase Po printr-un mediu, acesta va

absorbi o parte din radiaţie şi restul va trece sub forma unei radiaţii
P cu intensitate mai mica.

proba
sursă
b/l (cm) detector
P0 / I0 P/I

C (g/l)

Absorbţia radiaţiilor la trecerea printr-un mediu lichid 26

 Măsurarea radiaţiilor se face în transmitanţă sau absorbanţă:

I I
A  ε.b.c  - log T  - log  log 0
I0 I

T = I (P)/I0 (P0)
%T = 100(I/I0)
log Io/I = log 1/T = .c.b = A = E = D

unde:
- A, E, D = absorbanţa, extincţia, densitatea optică (D)
-  = coeficient molar de extincţie (absorbtivitate molara)
- b (l) = grosimea stratului străbătut (cm)
- c = concentraţia (mol/litru)
- T = transmitanţa
- I0 = intensitatea fasciculului luminos incident
- I = intensitatea fasciculului luminos după ce a străbătut mediul

Daca b = 1 cm, iar c = 1 mol/litru, A = 

 = absorbtivitate molara sau coeficient molar de extinctie = absorbanta

unei solutii de concentratie 1 mol/litru si grosimea stratului absorbant de 27
1
cm la o anumita lungime de unda
 Extincţie (Absorbanta) specifică = absorbanţa
corespunzătoare unei soluţii a cărei concentraţie este de 1 g %.

 Relaţiile mărimilor implicate sunt:

 În cazul determinării cantitative dintr-o probă:

unde:
- b = 1 cm
- c = g % pentru extinctia specifica, moli/l pentru  (coeficient
molar de extincţie)
- = absorbanţa specifică
- a = cantitatea de probă luată în lucru.
28
• Relaţia dintre coeficientul molar de extincţie şi extincţia specifică
este:

unde:
M = masa moleculară.

• Coeficientul molar de extincţie:

 este o mărime constantă
 depinde de :
■ lungimea de undă a luminii incidente
■ natura substanţei dizolvate
■ temperatura soluţiei
 corespunde extincţiei soluţiei molare a substanţei
 valoarea caracterizează sensibilitatea determinării
 cu cât are o valoare mai mare, cu atât şi sensibilitatea
determinării va fi mai mare.

29
 SPECTROMETRIA UV - VIS

 Regiunea spectrală:

UV - îndepărtat: 100 - 200 nm

UV - apropiat: 200 - 400 nm
VIS: 400 - 800 nm.

Absorbtia luminii in UV-VIS se datoreaza

prezentei cromoforilor
 Cromofori (grupe cromofore)
 sunt grupe de atomi, care prezente într-
o substanţă pot da naştere la spectre
electronice (de absorbţie).

 Grupă auxocromă
 este o grupă de atomi saturată care,
ataşată unui cromofor, modifică
lungimea de undă (max) la care are loc
absorbţia şi intensitatea maximă de
absorbţie.
30
a. deplasare batocromă (spre roşu)
- deplasarea maximului de absorbţie spre lungimi de undă mai mari,
ceea ce înseamnă că are loc cu energii de excitaţie mai mici

b. deplasare hipsocromă (spre albastru)

- deplasarea maximului de absorbţie spre lungimi de undă mai mici,
ceea ce se realizează cu ajutorul unei energii de excitaţie mai mari

c. efect hipercrom
- cresterea intensitatii absorbtiei

d. efect hipocrom
- micsorarea intensitatii absorbtiei

3131
Cauzele producerii spectrelor

 Energia luminoasă se absoarbe pe seama promovării

electronilor implicaţi în tranziţii dintr-un orbital de legătură 
sau  ocupat cu electroni în starea fundamentală într-un orbital
de antilegătură * sau * neocupat în starea fundamentală,
capabil de a fi ocupat în starea excitată.

 În afara electronilor  şi  în tranziţiile electronice sunt implicaţi

şi electronii neparticipanţi n, electroni de nelegătură, care pot fi
promovaţi în orbitalii de antilegătură * sau *.

32
 Din punct de vedere al participarii sau neparticiparii electronilor
existenti intr-o molecula, la tranzitiile electronice se disting
urmatoarele tipuri de electroni:

1. electroni de tip 
 Sunt implicati in legaturi covalente 
 au energii mari de excitare
 nu contribuie la absorbtia in UV-VIS (alcani)

2. electroni 
 situati pe orbitali  ai dublelor si triplelor legaturi
 usor excitabili si responsabili de majoritatea spectrelor electronice

3. electroni n
 sunt electroni neparticipanti in invelisul exterior de electroni ai unor
atomi de tipul N, O, S si halogeni
 sunt mai slab atrasi de nucleele acestor atomi decat electronii 
 pot fi excitati cu radiatii UV-VIS
 contribuie la absorbtiile din acest domeniu spectral
33
Tipuri de tranziţii:
- tranziţii  - * (alcani)
- tranziţii  - * (alchene, compuşi carbonilici, alchine, azo compuşi)
- tranziţii n - * (oxigen, azot, sulf, compuşi halogenaţi)
- tranziţii n - * (compuşi carbonilici)
- tranziţii d – d* (metale)

34
Tranziţii -*

• consta in tranzitia (saltul) unui electron de pe un orbital molecular de

legatura σ pe un orbital de antilegatura σ*

• necesita o energie mare

• apare in UV indepartat (< 200 nm)

• sunt caracteristice substantelor care contin numai legaturi simple;

exemple: legaturi C-H şi C-C

• legaturile σ în compusii organici au stabilitatea mare, ceea ce se

traduce printr-o diferenta de energie semnificativa intre orbitalii ocupati
si orbitalii liberi.

• sunt tranzitii puternice

35
Tranziţii -*

 consta in tranzitia (saltul) unui electron de pe un orbital molecular de

legatura  pe un orbital de antilegatura *

 sunt caracteristice compuşilor cu legături duble omogene sau

heterogene: C=C; N=N; C=O; N=O (alchene, compuşi carbonilici, alchine,
azo compuşi).

 sunt tranziţii puternice

36
Tranzitii n→*

 consta in tranzitia (saltul) unui electron de pe un orbital molecular de

nelegatura n pe un orbital de antilegatura σ*

 caracterizează substanţele organice care conţin în molecula lor

heteroatomi cu electroni neparticipanţi: O, N, S şi halogeni.

 tranzitiile au loc cu energii mai mici decat tranzitiile →*.

 au loc la lungimi de unda cuprinse intre 150-250 nm.

 numarul compusilor organici cu grupe functionale capabile de aceste

tranzitii in regiunea UV este mic.

R-X, X = Br, I

37
Tranziţii n-*
 consta in tranzitia (saltul) unui electron de pe un orbital molecular de
nelegatura n pe un orbital de antilegatura *

 sunt caracteristice compuşilor cu legături duble heterogene: C=N; C=S;

C=O; N=O compuşi carbonilici).

 Se produc prin trecerea unui electron din orbitalul de nelegatura n in

orbitalul de antilegatura *.

 necesită o energie mai mică decât cea -*

 au loc în plin domeniu UV pentru lungimi de undă cuprinse între 270 -

290 nm.

3838
Tranziţii d - d*
implica electronii din orbitalii moleculari d
sunt specifice compusilor anorganici
sunt ȋnsoţite de o absorbtivitate mică
datorită tranziţiilor dd* ionii unor metale sunt coloraţi (absorb în UV-
VIS)

Relaţiile dintre
absorbtivitatea molară
 şi lungimea de undă
a unor metale

39
APARATURA
• Aparatele utilizate pentru determinări spectrale poartă numele de
spectroscoape sau spectrometre.

• După tipul de receptor utilizat, spectrometrele pot fi:

cu citire vizuală
cu citire fotoelectrică
cu înregistrare fotografică
cu receptori termici.

40
Spectrometru UV-VIS cu monofascicul

Spectrometru UV-VIS cu fascicul dublu

41
Surse de spectru continuu
utilizate in UV-Vis

corp incandescent

becul cu filament de
lampa cu halogen
wolfram

descarcari electrice
in gaze

lampa cu deuteriu lampa de xenon

42
43
http://www.youtube.com/wat
ch?v=pxC6F7bK8CU

44
45
Reprezentarea spectrelor

 înregistrarea de către spectrofotometru fie a absorbanţei, fie a

transmisiei, fie a coeficientului molar de extincţie sau a logaritmu lui
acestui coeficient în funcţie de lungimea de undă.

Reprezentarea spectrelor în
UV a unor compuşi organici
(absorbanţă- lungime de
undă, coeficient molar de
extincţie-lungime de undă)

Reprezentarea spectrelor prin

absorbanţă molară ()-lungimea de
undă pentru cafeină şi aspirină
4646
 Aspecte privind determinările în UV – VIS
Legea Lambert-Beer este valabila numai pentru solutii diluate
deoarece la concentratii mai mari de 10-2 M solutiile au o forta
ionica ridicata, iar interactiunile electrostatice dintre componentii
solutiei sunt mai intense si nu va exista o linearitate
(proportionalitate intre concentratie si absorbanta)

Concentraţia probei trebuie astfel aleasă încât determinarea să

se înscrie în scala de înregistrare a aparatului şi în zona maximă
de acurateţe.

Solventii utilizati:
alegerea selectivă se face în funcţie de absorbţia substanţei de
analizat şi mărimea concentraţiei probei
nu trebuie să absoarbă în regiunea în care se face determinarea
sau se înregistrează spectrul.
trebuie să fie lipsiţi de impurităţi pentru a nu influenţa alura
curbelor înregistrate
trebuie să nu modifice maximele de absorbţie caracteristice
substanţei analizate.

47
 Absorbanţa în UV-VIS a unor solvenţi

Cei mai utilizaţi solvenţi sunt apa, alcoolul metilic, alcoolul etilic,
ciclohexanul, 1,4 - dioxanul etc.

48
 APLICAŢIILE SPECTROMETRIEI UV-VIS

1. Identificarea substanţelor medicamentoase

• Spectrele UV-VIS oferă informaţii în legătură cu:
 structura globală a electronilor substanţei analizate
 natura cromoforilor existenţi, poziţia lor faţă de alte elemente
structurale
 stereochimia moleculei
 existenţa legăturilor de hidrogen etc.

Hidrocarburi saturate
• Legăturile covalente existente în aceşti compuşi sunt puternice
şi pentru efectuarea unor tranziţii electronice sunt necesare
energii deosebit de mari, care au loc în domeniul UV de vid
greu accesibil cu aparatele obişnuite.
• Sunt substanţe transparente (nu absorb) şi de aceea au o
largă utilizare ca solvenţi pentru spectroscopia în UV-VIS.
49
Substanţe care conţin heteroatomi (O, S, N)

• În aceşti compuşi au loc tranziţiile -* şi n-*.

• Exemple: alcooli, amine, substanţe heterociclice cu N, sulfuri
etc.

Substanţe nesaturate

• Tranziţiile electronice care au loc sunt -*. Astfel:

- legătura C=C se caracterizează printr-o absorbţie la 165 nm,
- legătura C≡C la 173 nm.

• Cromoforul C=O se caracterizează printr-o bandă de absorbţie

de intensitate mare în regiunea 190-200 nm.

• Datorită tranziţiilor n-* mai apare o bandă de intensitate mai

slabă între 270 - 290 nm.

50
 Substanţe cu caracter acid şi derivaţi funcţionali

• Tranziţiile electronice de tip -* şi n-* caracterizează

substanţele prin absorbţii în UV de vid şi în domeniul:
- 200-210 nm pentru acizi
- 235 nm pentru cloruri
- 200 nm pentru amide
- 205-210 nm pentru esteri.

Poliene conjugate

• Cu cât lanţul este mai mare are loc o deplasare batocromă

mai accentuată.
• Exemplu: vitamina A absoarbe la 328 nm, provitamina A
(trans - beta - carotenul) la 450 nm, licopina la 472 nm.

• Creşterea numărului dublelor legături conjugate în moleculele

beta-carotenului, licopinei şi a dehidrolicopinei face ca aceste
substanţe să absoarbă în VIS şi să fie colorate în portocaliu,
roşu şi violet. 51
Compuşii aromatici

• prezintă spectre caracteristice în UV datorită conjugării

specifice stării aromatice.
• compuşii aromatici prezintă benzile caracteristice:
 E (etilenice) - 180-220 nm
 K (conjugate) - 220-250 nm
 B (benzilice) - 250-290 nm
 R (radicalice) - 275-330 nm.
• Benzile E şi B apar datorită tranziţiilor n-* si -*.
• Banda K apare la moleculele cu duble legaturi conjugate si se
datoresc unor tranzitii -* cu excitatii mari.
• Benzile R apar dacă pe nucleul aromatic este grefată o
grupare cromofora care posedă o pereche de electroni
neparticipanţi, fiind posibile tranziţii n-*, cu excitatii mici.
• Substituenţii introduşi pe nucleul aromatic produc modificări
în ceea ce priveşte absorbţia.
• Indiferent de natura substituentului se observă o deplasare
batocromă a benzii E. În funcţie de natura substituentului
sunt influenţate şi celelalte benzi.
52
• Identificarea famotidinei:
Spectrul UV al famotidină (5 μg/ml) în metanol (prezintă picuri
maxime la trei lungimi de undă.

λmax (nm) A (1 %, 1 cm) Absorbtivitate molară (l mol-1cm-1)

288.0 4.94 166.7

211.0 6.52 220.0

205.1 5.98 201.8

53
 • Identificarea citarabinei
Analiza spectroscopică în UV a citarabinei dizolvată ȋn acid clorhidric
0.1 mol/l a arătat un maxim la 281 nm

54
Substante determinabile spectrometric

55
 2. Metode de investigare a formării compuşilor de
incluziune

• Investigarea obţinerii compusului de incluziune dintre naproxen-β-

ciclodextrină

56
3. Determinarea cantitativă a substanţelor medicamentoase

• metoda standardului extern 

• metoda absorbantei specifice 
• metoda absorbtivităţii molare
• metoda curbei etalon - metoda celor mai mici pătrate

Exemple:
• Dozarea ofloxacinei din pulbere
vrac sau din formă farmaceutică
- solvenți: HCl 0.1 mol/l
- lungimea de undă = 293 nm.
- proba: comprimate ofloxacin de
concentraţie 200 mg/cpr
- metoda curbei etalon
- ecuația dreptei de regresie –
y = 0.121x - 0.015

57
• Dozarea flavonelor prin formarea unui complex între flavonoide
şi clorură de aluminiu din comprimate

reactivi: solutie clorura de aluminiu 0.1 M, acetat de potasiu 1 M, solutie

de hidroxid de sodiu 10 %.

58
Determinarea cefaclorului

Determinarea constă in spectrometrarea la 340 nm a 2,5-

dicetopiperazinei rezultate în tampon amoniacal la pH 10.

59
• Dozarea substantelor in amestec

• Presupunând substanţele A şi B ca făcând parte dintr-un preparat

farmaceutic, se trasează curba de absorbţie pentru cele două substanţe
dizolvate în acelaşi solvent

• Spectrul de absorbtie al amestecului celor doi componenti, A si B este

echivalent cu rezultatul insumarii spectrelor caracteristice celor doi
componenti.

• Se masoara absorbanta probei cu cele doua componente, la doua lungimi

de unda corespunzatoare maximelor de absorbtie a celor doua componente
(absorbantele sunt aditive)

Determinarea unui amestec de două substanţe 60

Se aplică legea aditivităţii:

Din sistemul obţinut se determină cantitativ conţinutul în cele

două substanţe:

unde:
- A(A + B)1, A(A + B)2 = absorbanţele determinate la două lungimi de
undă
- CA, CB = concentraţiile căutate
- A1A, A2A, A1B, A2B = absorbanţele specifice sau coeficienţii molari de
extincţie ai celor două substanţe la lungimile de undă respective.

Spectrometrele moderne permit determinarea automată a unui

amestec de doi sau mai mulţi componenţi.
61
4. Dozarea şi determinarea stabilităţii substanţelor

Degradarea unei molecule poate atrage după sine modificări în

spectrul UV-VIS al acesteia. Aceste modificări pot fi:
•scăderea absorbanţei la lungimea de undă corespunzătoare
maximului de absorbţie
•deplasarea maximului de absorbţie
•modificarea raporturilor absorbanţelor la două lungimi de undă
diferite.

62
 SPECTROMETRIA DERIVATĂ
 constă în transformarea unui spectru de absorbţie iniţial, de ordinul
zero, în spectre derivate de ordinul 1,2 şi n

 picurile spectrelor derivate sunt mai accentuate şi mai bine

diferenţiate
 importanţi sunt doi factori: ordinul
derivatei şi lungimea de undă la care
se calculează derivata. Practic este
vorba de o transformare electronică a
semnalului (absorbanţei).

6363
Spectrul derivat de ordinul 1

 un maxim corespunzător punctului de

inflexiune al părţii ascendente a
spectrului de ordinul zero
 un minim corespunzător punctului de
inflexiune din partea descendentă a
spectrului de ordinul zero.

Spectrul derivat de ordinul 2

 două maxime ce corespund celor două

puncte de inflexiune ale primei derivate
 un minim care se află la aceiaşi
lungime de undă cu maximul de
absorbţie din spectrul de ordinul zero

64
Spectrul derivat de ordinul 3

 două maxime, unul mai mic.

al doilea mai mare
 două minime din care unul
mai important datorită faptului că
ţine seama de maximele si
minimele spectrului derivat de
ordinul 2.

Spectrul derivat de ordinul 4 

 un maxim accentuat încadrat

între
 două maxime mai mici şi
 două minime accentuate.
 picul important (mai mare) este
situat la aceiaşi lungime de undă
cu maximul picului spectrului de
ordinul zero.
6565
 In practica analitică se utilizează spectrele derivate de ordinul 1
şi 2, adesea şi 4 datorită maximului situat la aceiaşi lungime de
undă cu maximul spectrului de ordinul zero.

 Avantajele spectrelor derivate:

 oferă o rezoluţie mai bună decât spectrul de ordinul zero, care
creşte odată cu creşterea ordinului
 amplitudinea picurilor derivate creşte odată cu ordinul derivatei
pentru o anumită amplitudine dată a picului iniţial (de ordinul
zero).

Diclofenac : spectrele derivate de ordinul zero şi 1

66
 Aplicatii

Spectrele unui amestec binar de tripolidina si pseudoefedrina

67
 TURBIDIMETRIA ŞI NEFELOMETRIA

Principii generale

 se bazeaza pe proprietatea particulelor solide de a dispersa

(a imprastia = a difuza) lumina incidenta, care strabate un
mediu heterogen care include analitul sub forma unor particule
fine.

 Fenomenul de difuziune se datorează împrăştierii radiaţiei

luminoase de către un mediu neomogen.

 Poate fi provocată de gaze, lichide sau solide.

 Principiul are la baza o reactie de transformare a unui analit

intr-o combinatie greu solubila care se formeaza treptat,
precipitatul avand forma unei suspensii fine, uniform
dispersate in mediul de reactie.

68
 Difuziunea cauzată de particulele solide este deosebit de
importantă.
 În cazul particulelor mici (diametrul < /10 a radiaţiei difuzate)
de formă sferică, intensitatea luminii difuzate (I) este dată de legea
lui Rayleigh:

unde:
- I0 = intensitatea luminii incidente
-  = lungimea de undă
- n şi n1 = indicele de refracţie al particulei dispersate, respectiv al
mediului
- N = numărul de particule din unitatea de volum
- v = volumul unei particule
- r = distanţa până la observator
-  = unghiul dintre direcţia luminii incidente şi a celei difuzate.
69
 Notând cu k mărimile constante, ecuaţia Rayleigh devine:

 Dacă dimensiunea particulelor este mult mai mare decât cea

indicată sau dacă ele nu sunt sferice, se observă abateri considerabile
de la ecuaţia Rayleigh.
 Intensitatea luminii difuzate se poate
determina pe două căi:
 prin determinarea scaderii
intensităţii fasciculului luminos
transmis în direcţia propagării acestuia
pana la echivalenta, dupa care nu se mai
modifica = turbidimetrie
 prin observarea directă a luminii
difuzate într-un unghi de 45o sau 90o
faţă de direcţia fasciculului incident =
nefelometrie sau tyndallometrie.
70
 Schema determinărilor turbidimetrice şi
nefelometrice

 Aceste metode sunt

compatibile cu cele
spectrometrice din punct de
vedere al exactităţii şi
sensibilităţii, însă domeniile de
aplicare sunt mult mai
restrânse.

 Dacă suspensia este densă,

lumina este difuzată puternic,
tehnica turbidimetrică fiind
mai indicată.

 În cazul când lumina

difuzată este slabă, tehnica
nefelometrică este mai
avantajoasă, deoarece se pot
determina intensităţi slabe
difuzate cu precizie mai mare.
7171
• Turbiditatea (S) unei suspensii:
 se defineşte în mod analog cu absorbanţa
 in domeniul concentraţiilor mici:

unde:
- K = coeficient de turbiditate
- l = grosimea stratului străbătut
- c = concentraţia particulelor dispersate (numărul).

• K (coeficientul de turbiditate) depinde de:

 forma si marimea particulelor
 lungimea de unda
 indicele de refractie al suspensiei

72
 Determinarea cantitativă

• Pentru o anumită suspensie, o aparatură dată şi în lumină

monocromatică, turbiditatea poate fi determinată prin o relatie
similară cu cea din spectrometria de absorbtie, Lambert – Beer.

• Este de preferat ca suspensia să nu fie colorată, respectiv

produsul de solubilitate al precipitatului să fie cât mai mic.

• Determinarea depinde de:

 concentraţie
 prezenţa substanţelor străine
 temperatură
 timp
 prezenţa coloizilor protectori etc.

73
Titrarea turbidimetrică

 Punctul de echivalenţă al unor titrări se poate sesiza mult mai

exact utilizând tehnica turbidimetrică, prin urmărirea absorbanţei
(turbidităţii) suspensiei în cursul titrării.

Schema unei aparat de titrare turbidimetrica

 
74
 pentru determinarea punctului de echivalenta se utilizeaza
curbele de titrare

 se reprezinta absorbanţa luminii difuzate în funcţie de volumul de

titrant adăugat

 toate curbele (1-8) au două

puncte deosebit de importante:
 începutul de precipitare
 punctul absorbţiei maxime.

 Volumul de echivalenta
corespunde absorbantei maxime.

Curbe de titrare
75
 APLICAŢIILE TURBIDIMETRIEI ŞI
NEFELOMETRIEI

 determinarea cantitativă a ionului sulfat si a bariului ca BaSO 4

 determinarea halogenurilor
 determinarea aluminiului, aurului, argintului, telurului
 caracterizarea unor sisteme nemiscibile (emulsii)
 controlul dezvoltării culturii de bacterii în medii lichide nutritive
 determinarea unor fracţiuni proteice separate SFC prin reacţia de
precipitare cu acid sulfosalicilic 3%
 analiza granulometrică a precipitatelor
 determinarea masei moleculare a unor polimeri
 determinarea alcaloizilor prin precipitare ca fosfomolibdati
 determinarea unor siropuri
 controlul unor aerosoli.
76