Analiza 10
Analiza 10
Analiza 10
ELECTROFOREZA
METODE SPECTROMETRICE
Spectrometria UV-VIS
Turbidimetria si nefelometria
1
ELECTROFOREZA
Definitie:
+ -
+ -2
Clasificare:
aplicată ionilor relativ mici se numeşte ionoforeză
aplicata pentru particule coloidale, micele şi unele macromolecule poartă
termenul de electroforeză.
Se pot separa:
compuşi metalici
complecşi cationici şi anionici
ioni proveniţi din electroliţi slabi (acizi carboxilici, baze organice, molecule
organice amfotere)
3
Migrarea particulelor încărcate, în câmp electric, se face cu o viteză
caracteristică fiecărei specii. Viteza de deplasare poartă numele de
“mobilitate electroforetică”().
4
Vâscozitatea mediului influenţează viteza de deplasare a
particulei:
unde:
E = câmpul electric
Q = sarcina particulei
r = raza particulei
= vâscozitatea.
5
Clasificarea metodelor electroforetice
6
Electroforeza în mediu liber
Migrarea electroforetică se realizează în coloană de lichid într-o
celulă formată dintr-un tub în formă de U umplut cu soluţie tampon
de electrolit, cu o secţiune pătrată, construit din sticlă transparentă
si un spectrometru.
Cei doi electrozi se leagă la o sursă de curent continuu şi se aplică o
diferenţă de potenţial de 100-150 volţi.
Aparatul conţine:
• generator de curent continuu cu tensiune
variabilã cuprinsã între 0 şi 250-500 V şi cu
o intensitate de cel mult 50 mA
• camerã de electroforezã cu douã
compartimente separate anodic şi catodic în
care se aflã doi electrozi de platinã şi în care
se poate pune soluţia de electrolit; electrozii
sunt legaţi la bornele generatorului
• densitometru prevãzut cu un înregistrator
de absorbanţã şi un integrator. 8
Metoda de analiză pe hârtie constă în:
proba de analizat se aplică pe banda de hârtie îmbibatã cu soluţie
tampon: tampon barbital pH = 8,6, tampon borat pH = 8,6 şi 9,0,
tampon fosfat pH = 6,3; 6,5; 7,0; 7,5, tampon ftalat pH = 5,9,
tampon acetat pH = 5,6; 4,0, tampon tris-glicină pH = 8,3
Fracţionarea are loc sub influenţa tensiunii aplicate la capetele
benzii.
Identificarea compuşilor separaţi se poate face prin:
- densitometrie
- culoare
- reacţii chimice cu reactivi adecvaţi
- absorbanţă
- fluorescenţă
unde:
fc = factor de corecţie ce depinde de tipul de hârtie utilizat.
9
Factorii care influenţează electroforeza
1. Natura moleculelor separate
mărimea particulelor
natura şi sarcina speciilor.
2. Aparatura
Suportul
3. Curentul electric
Deplasarea electroforetică este proporţională cu mobilitatea, câmpul electric şi cu
timpul de trecere al curentului electric → d = .E.t
4. pH-ul
Nu influenţează electroforeza acizilor, bazelor tari şi a sărurilor.
Compuşii organici de tipul acizilor carboxilici, bazelor aminate si substanţelor
amfotere migrează numai dacă pH-ul soluţiei de electroliţi este diferit de punctul
izoionic.
5. Natura soluţiei
Ỉn soluţie se pot găsi săruri, acizi, baze etc. care influenţează mobilitatea:
EDTA, acidul citric favorizează separarea unor ioni anorganici
Lauril sulfatul de sodiu (LSS) şi dodecilsulfatul de sodiu (DSS) desfac agregatele
prin fixarea de proteine cărora le conferă sarcină negativă.
10
Electroforeza capilară (EC)
Migrarea se face în tub capilar de silice topită, umplut cu o fază ce constituie
mediul de migrare (electroliţi tampon, gel). Capetele capilarelor se introduc în două
bacuri conţinând o soluţie apoasă de electrolit. Diferenţele de potenţial de circa 30
kV sunt furnizate de o sursă de alimentare. Electrozii din platină se introduc în
cele două bacuri. La un pH>3, peretele capilarei de silice se încarcă negativ
determinând acumularea de sarcini pozitive la suprafaţa electrolitului. Se formează
un flux electroosmotic în direcţia catodului.
11
Mediul de migrare: electroliţi tampon sau gel impregnat cu o
asemenea soluţie. Soluţiei i se pot adăuga:
solvenţi organici: acetonitril
agenţi tensioactivi: LSS, DSS
ciclodextrine
agenţi complexanţi, chelatizanţi sau sechestranţi
compuşi ionici ce conţin cromofori, fluorofori.
Migrarea particulelor:
Toţi compuşii încărcaţi electric se deplasează în electrolit cu o viteză
care depinde de mobilitatea lor electroforetică şi de condiţiile
experimentale.
Un alt factor care controlează migrarea soluţilor este curgerea
electrolitului numit flux electro-osmotic caracterizat prin mobilitate
electro-osmotică. Acest flux se află la originea deplasării tuturor
speciilor prezente într-o probă şi depinde de natura peretelui intern
al tubului capilar: negativ provoacă un flux electro-osmotic dirijat
spre catod şi invers; o suprafaţă pozitivă provoacă o dirijare a
acestuia spre anod.
12
Tehnicile electroforezei capilare
EOF
+ -
tm (min) 0
13
2. Electroforeza capilară micelară (MECE)
+ EOF
-
14
3. Electroforeza capilară pe gel (GCE)
+ -
Ep
15
4. Electroforeza capilară în contracurent
16
APLICAŢIILE ELECTROFOREZEI
IMUNOELECTROFOREZA
18
METODE SPECTRALE ỈN ANALIZA
MEDICAMENTELOR
SPECTROMETRIA UV-VIS
TURBIDIMETRIA, NEFELOMETRIA
SPECTROMETRIA DE FLUORESCENŢA
SPECTROMETRIA DE FOSFORESCENŢA
CHEMILUMINISCENŢA Radiatie reflectata
SPECTROMETRIA IR, FT-IR, NIR
SPECTROMETRIA RAMAN Absorbtie
SPECTROMETRIA ATOMICĂ
Radiatie incidenta Proba Radiatie transmisa
SPECTROMETRIA CU RAZE X
SPECTROMETRIA RES
SPECTROMETRIA DE MASĂ
SPECTROMETRIA RMN
Radiatie imprastiata Radiatie emisa
19
PRINCIPII GENERALE
Spectrometria = metode bazate pe măsurarea absorbţiei sau emisiei de
energie de catre substanţe în funcţie de lungimea de undă a radiaţiei.
20 20
Diagrama spectrului electromagnetic al luminii 21
Radiaţiile electromagnetice se
caracterizează prin:
lungimea de undă
frecvenţa
numărul de undă
unde:
= lungimea de undă (distanta in linie dreapta dintre doua maxime
consecutive ale unei unde elecromagnetice)
1 Å = 10-8 cm = 10-1 nm = 10-10 m
1 nm = 10-9 m =10-7 cm = 10 Å
1 m = 10-9 m = 10-6 mm
1 = 10-6 m = 10-3 mm
22
Fiecare radiatie luminoasa poarta o energie - cuanta de energie -
proportionala cu frecventa acesteia.
E = h = h.c/
Relaţia energie,
frecvenţă şi lungimea
de undă a radiaţiilor
25
Spectrele de absorbţie se obţin la trecerea unei radiaţii continue
provenite de la o sursă luminoasă prin substanţa de cercetat, care
absoarbe din spectru linii sau benzi.
proba
sursă
b/l (cm) detector
P0 / I0 P/I
C (g/l)
I I
A ε.b.c - log T - log log 0
I0 I
T = I (P)/I0 (P0)
%T = 100(I/I0)
log Io/I = log 1/T = .c.b = A = E = D
unde:
- A, E, D = absorbanţa, extincţia, densitatea optică (D)
- = coeficient molar de extincţie (absorbtivitate molara)
- b (l) = grosimea stratului străbătut (cm)
- c = concentraţia (mol/litru)
- T = transmitanţa
- I0 = intensitatea fasciculului luminos incident
- I = intensitatea fasciculului luminos după ce a străbătut mediul
unde:
- b = 1 cm
- c = g % pentru extinctia specifica, moli/l pentru (coeficient
molar de extincţie)
- = absorbanţa specifică
- a = cantitatea de probă luată în lucru.
28
• Relaţia dintre coeficientul molar de extincţie şi extincţia specifică
este:
unde:
M = masa moleculară.
29
SPECTROMETRIA UV - VIS
Regiunea spectrală:
Grupă auxocromă
este o grupă de atomi saturată care,
ataşată unui cromofor, modifică
lungimea de undă (max) la care are loc
absorbţia şi intensitatea maximă de
absorbţie.
30
a. deplasare batocromă (spre roşu)
- deplasarea maximului de absorbţie spre lungimi de undă mai mari,
ceea ce înseamnă că are loc cu energii de excitaţie mai mici
c. efect hipercrom
- cresterea intensitatii absorbtiei
d. efect hipocrom
- micsorarea intensitatii absorbtiei
3131
Cauzele producerii spectrelor
32
Din punct de vedere al participarii sau neparticiparii electronilor
existenti intr-o molecula, la tranzitiile electronice se disting
urmatoarele tipuri de electroni:
1. electroni de tip
Sunt implicati in legaturi covalente
au energii mari de excitare
nu contribuie la absorbtia in UV-VIS (alcani)
2. electroni
situati pe orbitali ai dublelor si triplelor legaturi
usor excitabili si responsabili de majoritatea spectrelor electronice
3. electroni n
sunt electroni neparticipanti in invelisul exterior de electroni ai unor
atomi de tipul N, O, S si halogeni
sunt mai slab atrasi de nucleele acestor atomi decat electronii
pot fi excitati cu radiatii UV-VIS
contribuie la absorbtiile din acest domeniu spectral
33
Tipuri de tranziţii:
- tranziţii - * (alcani)
- tranziţii - * (alchene, compuşi carbonilici, alchine, azo compuşi)
- tranziţii n - * (oxigen, azot, sulf, compuşi halogenaţi)
- tranziţii n - * (compuşi carbonilici)
- tranziţii d – d* (metale)
34
Tranziţii -*
35
Tranziţii -*
36
Tranzitii n→*
R-X, X = Br, I
37
Tranziţii n-*
consta in tranzitia (saltul) unui electron de pe un orbital molecular de
nelegatura n pe un orbital de antilegatura *
3838
Tranziţii d - d*
implica electronii din orbitalii moleculari d
sunt specifice compusilor anorganici
sunt ȋnsoţite de o absorbtivitate mică
datorită tranziţiilor dd* ionii unor metale sunt coloraţi (absorb în UV-
VIS)
Relaţiile dintre
absorbtivitatea molară
şi lungimea de undă
a unor metale
39
APARATURA
• Aparatele utilizate pentru determinări spectrale poartă numele de
spectroscoape sau spectrometre.
40
Spectrometru UV-VIS cu monofascicul
corp incandescent
becul cu filament de
lampa cu halogen
wolfram
descarcari electrice
in gaze
42
43
http://www.youtube.com/wat
ch?v=pxC6F7bK8CU
44
45
Reprezentarea spectrelor
Reprezentarea spectrelor în
UV a unor compuşi organici
(absorbanţă- lungime de
undă, coeficient molar de
extincţie-lungime de undă)
Solventii utilizati:
alegerea selectivă se face în funcţie de absorbţia substanţei de
analizat şi mărimea concentraţiei probei
nu trebuie să absoarbă în regiunea în care se face determinarea
sau se înregistrează spectrul.
trebuie să fie lipsiţi de impurităţi pentru a nu influenţa alura
curbelor înregistrate
trebuie să nu modifice maximele de absorbţie caracteristice
substanţei analizate.
47
Absorbanţa în UV-VIS a unor solvenţi
Cei mai utilizaţi solvenţi sunt apa, alcoolul metilic, alcoolul etilic,
ciclohexanul, 1,4 - dioxanul etc.
48
APLICAŢIILE SPECTROMETRIEI UV-VIS
Hidrocarburi saturate
• Legăturile covalente existente în aceşti compuşi sunt puternice
şi pentru efectuarea unor tranziţii electronice sunt necesare
energii deosebit de mari, care au loc în domeniul UV de vid
greu accesibil cu aparatele obişnuite.
• Sunt substanţe transparente (nu absorb) şi de aceea au o
largă utilizare ca solvenţi pentru spectroscopia în UV-VIS.
49
Substanţe care conţin heteroatomi (O, S, N)
Substanţe nesaturate
50
Substanţe cu caracter acid şi derivaţi funcţionali
Poliene conjugate
54
Substante determinabile spectrometric
55
2. Metode de investigare a formării compuşilor de
incluziune
56
3. Determinarea cantitativă a substanţelor medicamentoase
Exemple:
• Dozarea ofloxacinei din pulbere
vrac sau din formă farmaceutică
- solvenți: HCl 0.1 mol/l
- lungimea de undă = 293 nm.
- proba: comprimate ofloxacin de
concentraţie 200 mg/cpr
- metoda curbei etalon
- ecuația dreptei de regresie –
y = 0.121x - 0.015
57
• Dozarea flavonelor prin formarea unui complex între flavonoide
şi clorură de aluminiu din comprimate
58
Determinarea cefaclorului
59
• Dozarea substantelor in amestec
unde:
- A(A + B)1, A(A + B)2 = absorbanţele determinate la două lungimi de
undă
- CA, CB = concentraţiile căutate
- A1A, A2A, A1B, A2B = absorbanţele specifice sau coeficienţii molari de
extincţie ai celor două substanţe la lungimile de undă respective.
62
SPECTROMETRIA DERIVATĂ
constă în transformarea unui spectru de absorbţie iniţial, de ordinul
zero, în spectre derivate de ordinul 1,2 şi n
6363
Spectrul derivat de ordinul 1
64
Spectrul derivat de ordinul 3
67
TURBIDIMETRIA ŞI NEFELOMETRIA
Principii generale
68
Difuziunea cauzată de particulele solide este deosebit de
importantă.
În cazul particulelor mici (diametrul < /10 a radiaţiei difuzate)
de formă sferică, intensitatea luminii difuzate (I) este dată de legea
lui Rayleigh:
unde:
- I0 = intensitatea luminii incidente
- = lungimea de undă
- n şi n1 = indicele de refracţie al particulei dispersate, respectiv al
mediului
- N = numărul de particule din unitatea de volum
- v = volumul unei particule
- r = distanţa până la observator
- = unghiul dintre direcţia luminii incidente şi a celei difuzate.
69
Notând cu k mărimile constante, ecuaţia Rayleigh devine:
unde:
- K = coeficient de turbiditate
- l = grosimea stratului străbătut
- c = concentraţia particulelor dispersate (numărul).
72
Determinarea cantitativă
73
Titrarea turbidimetrică
Volumul de echivalenta
corespunde absorbantei maxime.
Curbe de titrare
75
APLICAŢIILE TURBIDIMETRIEI ŞI
NEFELOMETRIEI