펩타이드 질량 지문 채취

Peptide mass fingerprinting
펩타이드 대량 지문 채취 실험의 일반적인 워크플로우.

펩타이드 질량지문(PMF, 일명 단백질지문)은 관심의 알려지지 않은 단백질을 먼저 작은 펩타이드로 분해하는 단백질 식별을 위한 분석 기법으로, 절대 질량을 MALDI-TOF나 ESI-TOF와 같은 질량분석기로 정확하게 측정할 수 있다.[1] 이 방법은 1993년 여러 집단에 의해 독자적으로 개발되었다.[2][3][4][5][6] 펩타이드 질량은 알려진 단백질 서열을 포함하는 데이터베이스 또는 게놈과 비교된다. 이것은 유기체의 알려진 게놈을 단백질로 변환한 다음 이론적으로 단백질을 펩타이드로 절단하고 각 단백질로부터 펩타이드의 절대 질량을 계산하는 컴퓨터 프로그램을 사용함으로써 달성된다. 그런 다음 그들은 알려지지 않은 단백질의 펩타이드 질량을 게놈에 인코딩된 각 단백질의 이론 펩타이드 질량과 비교한다. 그 결과는 통계적으로 분석하여 가장 잘 맞는 결과를 찾아낸다.

이 방법의 장점은 펩타이드의 질량만 알면 된다는 것이다. 시간이 많이 소요되는 데 노보펩타이드 염기서열은 불필요하다. 단점은 관심 데이터베이스에 단백질 서열이 존재해야 한다는 것이다. 또한 대부분의 PMF 알고리즘은 펩타이드가 단일 단백질에서 나온다고 가정한다.[7] 혼합물의 존재는 분석을 상당히 복잡하게 하고 결과를 잠재적으로 손상시킬 수 있다. PMF 기반 단백질 식별을 위한 대표적인 것이 격리된 단백질의 요건이다. 2-3개 단백질의 수를 초과하는 혼합물은 일반적으로 식별의 충분한 특수성을 달성하기 위해 MS/MS 기반 단백질 식별을 추가로 사용해야 한다(6). 따라서 대표적인 PMF 샘플은 2차원 겔 전기영동체(2D겔)로부터 격리된 단백질이나 고립된 SDS-PAGE 대역이다. MS/MS에 의한 추가 분석은 예를 들어 MALDI-TOF/TOF 분석 또는 젤 스폿 용출물의 다운스트림 나노LC-ESXI-MS/MS 분석 중 하나일 수 있다.[7][8]

오리진스

단백질을 분석하는 길고 지루한 과정 때문에, 펩타이드 질량 지문 채취가 개발되었다. 단백질 분석에는 에드만 열화가 사용되었고, 아미노산 잔류물 1개를 분석하는데 거의 1시간이 걸렸다.[9] SDS-PAGE는 또한 매우 복잡한 혼합물에서 단백질을 분리하는데 사용되었고, 이것은 또한 전기 블로팅과 얼룩을 내는 방법을 사용했다.[10] 그런 다음, 밴드가 젤에서 추출되어 자동으로 시퀀싱된다. 그 과정에서 반복되는 문제는 간섭 단백질도 관심 단백질로 정화한다는 것이었다. 이 간섭 단백질들의 배열은 데이호프 데이터베이스로 알려지게 되었다.[11] 궁극적으로, 데이터베이스에 이러한 알려진 단백질 오염물질의 시퀀스를 보유하게 되면, 단백질 분석에 수반되는 계측기 시간과 비용이 감소하게 된다.

시료준비

단백질 샘플은 SDS-PAGE[7] 또는 역상 HPLC에서 추출될 수 있으며, 그 다음 화학적 변형을 받는다. 단백질의 이황화 교량은 감소되고 시스테인 아미노산은 화학적으로 카바미도메틸화되거나 젤 전기영양증 동안 아크릴아밀화된다.

그리고 나서 단백질은 트립신, 치모트립신 또는 글루-C와 같은 단백질 분해 효소를 사용하여 여러 조각으로 잘라진다. 일반적인 샘플:단백질 비율은 50:1이다. 프로테톨리시스(proteolyis)는 일반적으로 하룻밤 사이에 진행되며, 결과 펩타이드들은 아세토나이트릴로 추출되어 진공 상태에서 건조된다. 그런 다음 펩타이드들은 소량의 증류수에 용해되거나 더욱 농축되고 정제되어 질량분광분석을 할 준비가 된다.

질량분석

소화된 단백질은 ESI-TOF나 MALDI-TOF와 같은 다양한 종류의 질량분광기로 분석할 수 있다. MS/MS 분석으로 보완할 경우 단일 실험에서 높은 샘플 처리량과 여러 단백질을 분석할 수 있기 때문에 MALDI-TOF는 종종 선호되는 기기다. LC/ESI-MS와 CE/ESI-MS도 펩타이드 대량 지문 채취에 훌륭한 기술이다.[12][13]

펩타이드의 소분수(보통 1마이크로리터 이하)가 MALDI 대상에 피펫팅되고 펩타이드 혼합물에 매트릭스라는 화학물질이 첨가된다. 일반적인 매트릭스는 시나핀산, 알파-시아노-4-히드록시신동산, 2,3-다이드록시벤조산이다. 매트릭스 분자는 펩타이드 분자의 탈착을 위해 필요하다. 매트릭스와 펩타이드 분자는 MALDI 대상에 공동결정되며 분석할 준비가 되어 있다. 주로 MALDI-MS 검체 준비 기법, 즉 건조 드롭트 기법이 있다.[14] 표적은 질량분석기의 진공실에 삽입되고 폴리펩타이드 조각의 탈착과 이온화는 고량의 에너지를 매트릭스 분자로 전달하는 펄스 레이저 빔에 의해 시작된다. 에너지 전달은 매트릭스 분자와 펩타이드의 이온화 및 전환을 고형상에서 기체 단계로 촉진하기에 충분하다. 이온은 질량분석기의 전기장에서 가속되어 전기신호로 감지되는 이온 검출기를 향해 날아간다. 이들의 질량 대 충전 비율은 드리프트 튜브 내 비행 시간(TOF)에 비례하며 그에 따라 계산할 수 있다.

모세혈관 LC와 ESI를 결합하면 펩타이드와 단백질 소화물을 분리하는 동시에 분자 질량을 얻을 수 있다.[15] ESI-MS와 결합된 모세관 전기영양도 다른 기술이지만 소량의 단백질을 분석할 때 가장 효과적이다.[13]

계산분석

질량분광 분석은 종종 피크 리스트라고 불리는 파편들의 분자량 목록을 생성한다. 펩타이드 질량은 단백질 시퀀스 정보를 담고 있는 스위스프로트와 같은 단백질 데이터베이스와 비교된다. 소프트웨어는 화학적 갈라짐 반응에 사용되는 동일한 효소(예: 트립신)로 데이터베이스의 단백질에 대한 실리코 소화를 수행한다. 이 펩타이드 조각의 질량을 계산하여 측정된 펩타이드 질량의 피크 목록과 비교한다. 결과는 통계적으로 분석되고 가능한 일치항목이 결과표에서 반환된다.

참고 항목

참조

  1. ^ Clauser KR, Baker P, Burlingame AL (1999). "Role of accurate mass measurement (+/- 10 ppm) in protein identification strategies employing MS or MS/MS and database searching". Anal. Chem. 71 (14): 2871–82. doi:10.1021/ac9810516. PMID 10424174.
  2. ^ Pappin DJ, Hojrup P, Bleasby AJ (1993). "Rapid identification of proteins by peptide-mass fingerprinting". Curr. Biol. 3 (6): 327–32. doi:10.1016/0960-9822(93)90195-T. PMID 15335725. S2CID 40203243.
  3. ^ Henzel WJ, Billeci TM, Stults JT, Wong SC, Grimley C, Watanabe C (1993). "Identifying proteins from two-dimensional gels by molecular mass searching of peptide fragments in protein sequence databases". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (11): 5011–5. Bibcode:1993PNAS...90.5011H. doi:10.1073/pnas.90.11.5011. PMC 46643. PMID 8506346.
  4. ^ Mann M, Højrup P, Roepstorff P (1993). "Use of mass spectrometric molecular weight information to identify proteins in sequence databases". Biological Mass Spectrometry. 22 (6): 338–45. doi:10.1002/bms.1200220605. PMID 8329463.
  5. ^ James P, Quadroni M, Carafoli E, Gonnet G (1993). "Protein identification by mass profile fingerprinting". Biochem. Biophys. Res. Commun. 195 (1): 58–64. doi:10.1006/bbrc.1993.2009. PMID 8363627.
  6. ^ Yates JR, Speicher S, Griffin PR, Hunkapiller T (1993). "Peptide mass maps: a highly informative approach to protein identification". Anal. Biochem. 214 (2): 397–408. doi:10.1006/abio.1993.1514. PMID 8109726.
  7. ^ a b c Shevchenko A, Jensen ON, Podtelejnikov AV, Sagliocco F, Wilm M, Vorm O, Mortensen P, Shevchenko A, Boucherie H, Mann M (1996). "Linking genome and proteome by mass spectrometry: large-scale identification of yeast proteins from two dimensional gels". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (25): 14440–5. Bibcode:1996PNAS...9314440S. doi:10.1073/pnas.93.25.14440. PMC 26151. PMID 8962070.
  8. ^ Wang W, Sun J, Nimtz M, Deckwer WD, Zeng AP (2003). "Protein identification from two-dimensional gel electrophoresis analysis of Klebsiella pneumoniae by combined use of mass spectrometry data and raw genome sequences". Proteome Science. 1 (1): 6. doi:10.1186/1477-5956-1-6. PMC 317362. PMID 14653859.
  9. ^ Henzel, William J.; Watanabe, Colin; Stults, John T. (2003-09-01). "Protein identification: The origins of peptide mass fingerprinting". Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 14 (9): 931–942. doi:10.1016/S1044-0305(03)00214-9. ISSN 1044-0305. PMID 12954162.
  10. ^ Matsudaira, P. (1987-07-25). "Sequence from picomole quantities of proteins electroblotted onto polyvinylidene difluoride membranes". The Journal of Biological Chemistry. 262 (21): 10035–10038. doi:10.1016/S0021-9258(18)61070-1. ISSN 0021-9258. PMID 3611052.
  11. ^ B C Orcutt; D G George; Dayhoff, and M. O. (1983). "Protein and Nucleic Acid Sequence Database Systems". Annual Review of Biophysics and Bioengineering. 12 (1): 419–441. doi:10.1146/annurev.bb.12.060183.002223. PMID 6347043.
  12. ^ Moore, R. E.; Licklider, L.; Schumann, D.; Lee, T. D. (1998-12-01). "A microscale electrospray interface incorporating a monolithic, poly(styrene-divinylbenzene) support for on-line liquid chromatography/tandem mass spectrometry analysis of peptides and proteins". Analytical Chemistry. 70 (23): 4879–4884. doi:10.1021/ac980723p. ISSN 0003-2700. PMID 9852776.
  13. ^ a b Whitmore, Colin D.; Gennaro, Lynn A. (2012-06-01). "Capillary electrophoresis-mass spectrometry methods for tryptic peptide mapping of therapeutic antibodies". Electrophoresis. 33 (11): 1550–1556. doi:10.1002/elps.201200066. ISSN 1522-2683. PMID 22736356. S2CID 28717319.
  14. ^ Thiede, Bernd (2005). "Peptide mass fingerprinting". Methods. 35 (3): 237–247. doi:10.1016/j.ymeth.2004.08.015. PMID 15722220.
  15. ^ Dass, Chhabil (2007). Fundamentals of Contemporary Mass Spectrometry Wiley Online Books. doi:10.1002/0470118490. ISBN 9780470118498.

외부 링크

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