Electroforesis
Electroforesis
Electroforesis
Qu es la electroforesis?
La electroforesis es una tcnica de separacin que
Protenas
cidos nucleicos
Otras biomolculas
Permite determinar:
Peso molecular de una protena
Punto isoelctrico
Distinguir molculas por su carga neta o su forma
1)
)
)
2)
)
)
)
)
3)
)
)
Tenemos:
Parmetros externos
Campo elctrico
Temperatura
Parmetros relacionados con el solvente y con el sistema
electrofortico
Viscosidad
Fuerza inica
La naturaleza de los iones componentes
El pH
Parmetros relacionados con el soluto
La carga
La forma y tamao de los iones
fuente de
alimentacin
cable
ctodo
nodo
electrodo
muestra
gel
electrodo
Componentes:
* Fuente de alimentacin
* Dos
(E. horizontal)
tampn
cubeta
muestra
electrodo
ctodo
cubeta
cable
nodo
* Cubeta
* Tampn de electroforesis
* Soporte electrofortico
(gel)
gel
fuente de
alimentacin
(E. vertical)
electrodos
nodo (+)
ctodo (-)
tampn
Tipos de Electroforesis
De frente mvil: los componentes de la muestra
Frente mvil
Aquella en la cual las partculas se mueven de forma libre en el
De zona
La disolucin a tratar se aplica como una mancha, o como una
banda, y las partculas migran a travs de un disolvente,
utilizando adems un medio soporte inerte y homogneo, tal
como el papel o ciertos tipos de geles. Esta tcnica es utilizada
para analizar mezclas, para determinar la pureza de una muestra,
para detectar cambios de movilidad o de conformacin de
sustancias.
papel
acetato de celulosa
gel de almidn
gel de agarosa
separacin
principalmente por
carga
Papel
PapelFiltro
Filtro
protenas
oligonucletidos
carbohidratos
lpidos
Desventajas
Si el papel es fino, se puede desgarrar con facilidad.
Si el papel es grueso, las bandas se distorsionan.
Se produce interaccin entre las protenas y los grupos
biolgicos.
Acetato
Acetatode
decelulosa
celulosa
Gel
Gel
Almidn
Geles
Geles
Poliacrilamida
Tcnica barata,
fcil y rpida
Soporte ms usado en
electroforesis.
De alta resolucin
Sus componentes son txicos
Buena resolucin
Agarosa
Separacin de molculas
grandes (virus, cidos
nucleicos, lipoprotenas)
Posicin de soportes
Ensayo enzimtico
Autorradiografia
determinada de nucletidos se
pueden detectar mediante
hibridacin con sondas especficas,
pequeas molculas de
oligonucletidos con la secuencia
complementaria a la buscada y
marcadas con un istopo radiactivo,
un grupo fluorescente, etc. Para
llevar a cabo con xito la hibridacin
se requiere tambin la transferencia
desde el gel a una membrana de
nitrocelulosa o nailon.
Isoelectroenfoque
(Tambin se llama enfoque isoelctrico o IEF, de
Electroforesis Bidimensional
Tras realizar una primera separacin su resultado se somete a otra
Electroforesis de Campo
pulsante
Se emplean geles de agarosa al 1%, pero se altera peridicamente la
Aplicaciones
La principal aplicacin en la caracterizacin y anlisis
WESTERN BLOT
Desarrollada en el laboratorio de George
Paso 2. Cuantificacin de
protenas
Porqu cuantificar protenas? Es muy simple,
Paso 5. Transferencia.
Paso que permite que las protenas sean accesibles a la
Paso 7. Deteccin.
Se trata de buscar en la membrana una
Paso 8. Anlisis
Simplemente, dependiendo del tipo de anticuerpo secundario
Paso 9. Resultado
Resultado del Western blot: una membrana
NORTHERN BLOT
PROCEDIMIENTO
El procedimiento general
entonces separadas
porelectroforesis en gel.
APLICACIONES
El northern Blot permite observar
mostrar la sobreexpresin de
oncogenes y la desregulacin de
genes supresores tumorales en
clulas cancerosas cuando son
comparadas con tejidos
normales.
Southern blot
Edwin Southern
Sir Edwin Mellor Southern.
Naci el 07 de junio 1938
en Burnley , Lancashire y
fue educado en Burnley
Grammar School.
Premiado por la invencin
de la transferencia
Southern.
de
Southern Blot
Principio de la tcnica
Pasos de la tcnica
Mecanismo de accin de la
enzima
Rompe el ADN en la secuencia GGCC.
Corte entre 2 y 3 nucletido. (G y C).
El ADNt conocido como fragmentos de restriccin.
HaeIII corta las cadenas de ADN en la misma localizacin .
La desnaturalizacin caliente ocurre a los 80C despus de 20
minutos.
Electroforesis
Hibridacin
SondasScorpion
Molculas mixtas Contienen un cebador
especfico para el amplicn unido a una horquilla
similar a la sonda del tipo beacon
http://www.youtube.com/watch?v=VmCTsm
hx2_w
http://www.youtube.com/watch?v=NaDGkF1
6Jm8
Aplicaciones de la tcnica
Utilizado para clonacin basada en homologa en base a
Problema 1
En una electroforesis de alto voltaje en papel a
Problema
Se ha determinado la movilidad relativa de la