Mycoplasma Pneumoniae Iggigm GM 1015
Mycoplasma Pneumoniae Iggigm GM 1015
Mycoplasma Pneumoniae Iggigm GM 1015
MYCOPLASMA PNEUMONIAE
ELISA IgG/IgM
G/M1015: Prueba inmunoenzimtica indirecta para determinar anticuerpos
IgG y/o IgM frente a Mycoplasma pneumoniae en suero humano. 96 tests.
INTRODUCCIN:
M. pneumoniae produce neumona atpica primaria con mayor frecuencia
en nios y adolescentes. El aislamiento en cultivo de M. pneumoniae es
complejo, por lo que el diagnstico se suele realizar por mtodos
serolgicos. Puede detectarse IgM a M. pneumoniae una semana despus
de la aparicin de los sntomas e IgG a partir de la segunda semana. Sin
embargo no en todos los pacientes (especialmente en caso de
reinfecciones) aparece IgM. Un 56% de los enfermos mayores de 40 aos
presentan slo respuesta de IgG en el curso de la enfermedad, mientras que
los nios dan generalmente respuesta de IgM. Los anticuerpos IgM son un
buen marcador de enfermedad aguda porque persisten slo durante 3-4
meses, sin embargo los anticuerpos IgG se mantienen durante aos tras la
infeccin. El mtodo serolgico ms clsico ha sido la reaccin de fijacin
de complemento (RFC), aunque actualmente se utilizan sobre todo ELISA
e IFI.
FUNDAMENTO DEL MTODO:
Mtodo de ELISA basado en la reaccin de los anticuerpos de la muestra
con el antgeno unido a la superficie de poliestireno. Las inmunoglobulinas
no unidas por reaccin con el antgeno son eliminadas en el proceso de
lavado. En un paso posterior la globulina anti-humana reacciona con el
complejo antgeno-anticuerpo, y la que no se une es eliminada por los
lavados; la unida reacciona con el sustrato (TMB), para dar una reaccin
coloreada azul, que cambia a amarillo tras la adicin de la solucin de
parada.
Producto coloreado
Peroxidasa
Antgeno de M. pneumoniae
CARACTERSTICAS:
Todos los reactivos a excepcin de la solucin de lavado vienen listos para
su uso.
Las soluciones de dilucin de muestras y de conjugado estn coloreadas
como ayuda a la realizacin de la tcnica.
No se precisa dilucin previa de la muestra.
Los pocillos son individuales, por lo que slo se consumen tantos pocillos
como pruebas se van a realizar.
COMPONENTE
Solucin de lavado diluida
(1x)
Resto de componentes
ESTABILIDAD
4 meses a 2-8C
Fecha indicada en envase a 2-8C
Fabricante: VIRCELL, S.L. Pza. Domnguez Ortiz 1. Polgono Industrial Dos de Octubre.18320 Santa Fe *GRANADA* SPAIN* Tel.+34.958.441264* Fax+34.958.510712
http://www.vircell.com
ES
uno para el control negativo y dos para el suero cut off. Colocar el resto de
los pocillos en el sobre y volver a cerrarlo.
5.-Para determinacin de anticuerpos IgG aadir 100 l de diluyente de
muestras 2 a todos los pocillos que se vayan a emplear. Aadir 5 l de las
muestras, 5 l del control positivo 3G, 5 l del suero cut off 4G (en
duplicado) y 5 l del control negativo 5G en los pocillos correspondientes.
En el caso de la realizacin manual del mtodo, se agitar la placa en un
agitador (2 minutos) para garantizar una mezcla homognea de los
reactivos. Si no es posible asegurar esta agitacin, debe hacerse una
predilucin de la muestra en tubo o placa aadiendo el doble del volumen
de diluyente de muestras 2 y de muestra. Homogenizar con la pipeta y
trasvasar seguidamente 105 l de cada muestra ya diluida a los pocillos 1.
6.-Para determinacin de anticuerpos IgM aadir 25 l de sorbente IgG
(ref. Vircell S001) a todos los pocillos que se vayan a emplear, excepto a
los pocillos donde se dispensen los controles. Aadir 5 l de las muestras y
seguidamente 75 l de diluyente de muestras 2 a todos los pocillos
empleados. Para la preparacin de los pocillos de los controles, aadir 100
l de diluyente de muestra 2, y seguidamente 5 l del control positivo 3M,
5 l del suero cut off 4M (en duplicado), y 5 l del control negativo 5M
en los pocillos correspondientes. En el caso de la realizacin manual del
mtodo, se agitar la placa en un agitador (2 minutos) para garantizar una
mezcla homognea de los reactivos. Si no es posible asegurar esta
agitacin, debe hacerse una predilucin de la muestra en tubo o placa
aadiendo el doble del volumen de los reactivos y de muestra.
Homogenizar con la pipeta y trasvasar seguidamente 105 l de cada
muestra ya diluida a los pocillos 1.
7.-Tapar mediante lmina adhesiva e incubar en estufa/bao durante 45
minutos a 371C.
8.-Retirar la lmina adhesiva, aspirar el contenido de todos los pocillos y
lavar cada uno de ellos 5 veces con 0,3 ml de solucin de lavado 9,
asegurndose que no quedan restos de solucin de lavado.
9.-Aadir inmediatamente 100 l de conjugado IgG 6G o IgM 6M a todos
los pocillos.
10.-Tapar mediante lmina adhesiva e incubar en estufa/bao durante 30
min. a 371C.
11.-Retirar la lmina adhesiva, aspirar el contenido de todos los pocillos y
lavar cada uno de ellos 5 veces con 0,3 ml de solucin de lavado 9,
asegurndose que no quedan restos de solucin de lavado.
12.-Aadir inmediatamente 100 l de solucin de sustrato 7 a todos los
pocillos.
13.-Incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos, en la oscuridad.
14.-Aadir inmediatamente 50 l de solucin de parada 8 a todos los
pocillos.
15.-Valorar espectrofotomtricamente a 450/620 nm, antes de 1 hora de
acabado el ensayo.
CONTROL DE CALIDAD INTERNO:
Cada lote se somete a control de calidad interno antes de su liberacin
asegurando el cumplimiento del protocolo de validacin por el usuario
mediante especificaciones ms estrictas. Los resultados de control final de
cada lote estn disponibles.
La correlacin del material de control se asegura mediante ensayos
paralelos frente a paneles de sueros de referencia internamente validados.
PROTOCOLO DE VALIDACIN POR EL USUARIO:
D.O.
>0,9
<0,5
>0,55
<1,5
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ES
INTERPRETACIN DE RESULTADOS:
Calcular la media de las D.O. del suero cut off.
ndice de anticuerpos=(D.O. de la muestra/media de D.O. del suero cut off) x 10
INDICE
<9
9-11
>11
INTERPRETACIN
Negativo
Dudoso
Positivo
N MUESTRAS
SENSIBILIDAD
ESPECIFICIDAD
85
98%
97%
IgG
70
97%
97%
IgM (1)
73
88%
100%
IgM (2)
80
97%
92%
IgM (3)
Los valores indeterminados fueron suprimidos de los clculos finales
PRECISIN INTRAENSAYO:
Las muestras con resultados dudosos deben ser vueltas a analizar y/o
solicitar una nueva muestra para confirmacin de los resultados.
Las muestras con ndices inferiores a 9 se considera que no tienen
anticuerpos especficos frente a M. pneumoniae IgG o IgM, segn el
procedimiento empleado.
Las muestras con ndices superiores a 11 se considerar que tienen
anticuerpos especficos frente a M. pneumoniae IgG o IgM, segn el
procedimiento empleado.
LIMITACIONES DEL MTODO:
1.-Este mtodo est diseado para ser utilizado con suero humano.
2.-El uso de este kit requiere la cuidadosa lectura y comprensin del folleto
de instrucciones. Es necesario seguir estrictamente el protocolo para
obtener resultados fiables, en particular el correcto pipeteo de muestras y
reactivos, lavados y tiempos de incubacin.
3.-Los resultados de las muestras deben ser valorados junto con la
sintomatologa clnica y otros procedimientos diagnsticos. El diagnstico
definitivo debe realizarse mediante tcnicas de aislamiento.
4.-El test no indica el lugar de la infeccin. No pretende sustituir al
aislamiento.
5.-La ausencia de un aumento significativo en el nivel de anticuerpos no
excluye la posibilidad de infeccin.
6.-Las muestras recogidas muy pronto en el transcurso de una infeccin
pueden no tener niveles detectables de IgG. En esos casos se recomienda
realizar un ensayo para determinacin de IgM u obtener una segunda
muestra transcurridos entre 14 y 21 das para ser ensayado en paralelo con
la muestra original con el fin de determinar una seroconversin.
7.-Los resultados obtenidos en la deteccin de IgG en neonatos deben ser
interpretados con precaucin, ya que las IgG maternas son transferidas
pasivamente de la madre al feto antes del nacimiento. La determinacin de
IgM es mejor indicador de infeccin en nios menores de 6 meses.
8.-Los resultados de determinacin de anticuerpos de una muestra nica no
deben ser usados para el diagnstico de una infeccin reciente. Se deben
recoger muestras pareadas (aguda y convaleciente) para ser ensayadas
paralelamente y determinar seroconversin o un incremento significativo
en el nivel de anticuerpos.
9.-Para la determinacin de IgM se debe realizar la tcnica utilizando
sorbente de anticuerpos IgG humanos ya que de otro modo se pueden
obtener resultados falsos positivos por la presencia de factor reumatoide o
resultados falsos negativos por exceso de anticuerpos IgG.
DETECCIN IgG
Se ensayaron 3 sueros pipeteados individualmente 10 veces cada uno en un
nico ensayo realizado por el mismo operador en condiciones de trabajo
idnticas, obteniendo los resultados:
SUERO
N
% C.V.
CP
10
2,13
CN
10
10,64
CO
10
5,87
C.V. Coeficiente de variacin
DETECCIN IgM
Se ensayaron 3 sueros pipeteados individualmente 10 veces cada uno en un
nico ensayo realizado por el mismo operador en condiciones de trabajo
idnticas, obteniendo los resultados:
SUERO
N
% C.V.
CP
10
5,87
CN
10
9,95
CO
10
5,60
C.V. Coeficiente de variacin
PRECISIN INTERENSAYO:
DETECCIN IgG
Se ensayaron 3 sueros pipeteados individualmente durante 5 das
consecutivos y por 2 operadores diferentes, obteniendo los siguientes
resultados:
SUERO
N
% C.V.
CP
10
2,20
CN
10
8,32
CO
10
4,71
C.V. Coeficiente de variacin
DETECCIN IgM
Se ensayaron 3 sueros pipeteados individualmente durante 5 das
consecutivos y por 2 operadores diferentes, obteniendo los siguientes
resultados:
SUERO
N
% C.V.
CP
10
4,39
CN
10
10,28
CO
10
6,31
C.V. Coeficiente de variacin
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ES
BIBLIOGRAFA:
2C
Lote
Referencia (catlogo)
<X> pocillos
45 min. a 37C
REVISADO: Diciembre-10
6G 100 l de conjugado 6M
30 min. a 37C
100 l de sustrato 7
50 l de solucin de parada 8
Lectura a 450/620 nm
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