Validación de Métodos Analíticos
Validación de Métodos Analíticos
Validación de Métodos Analíticos
MICROBILOGAS INDUSTRIALES
NOTA DE ADVERTENCIA
APROBADO
_____________________
_____________________
Directora
Codirector
_____________________
_____________________
NADENKA MELO
ANDRES OTALORA
Jurado
Jurado
APROBADO
_________________________
_____________________________
M. Phil
A Dios por guiarme siempre por el mejor camino. A mi mam por ser mi mejor ejemplo de lucha y constancia. A mi
hermana por impulsarme a ser cada vez mejor. A toda mi familia por apoyarme en mis decisiones y estar conmigo
siempre que los necesito. A mis amigos por su incondicional apoyo. A todos mil Gracias.
GRACIAS a Dios por ser mi luz y mi fuerza cada da y por permitirme culminar esta etapa junto a las personas
que ms amo. A mi mam por brindarme lo mejor de sus das. A mi pap por cuidarme en cada instante de mi vida. A
mi hermana por ensearme que la lucha constante nos hace grandes triunfadores. A mis hermanos porque son mi
alegra y mi compaa. Les quiero decir que son mi mayor motivo en la vida, lo ms importante e indispensable para
mi. A Sergio Muoz porque su amor me ha ayudado a superar los ms difciles obstculos. A mis amigos por crecer
conmigo y ensearme cada da cosas nuevas. A Maria Andrea por querer cumplir este gran logro junto a mi.
Dios los bendiga.
AGRADECIMIENTOS
A la Dra. Lorena Valencia por todo su apoyo y dedicacin y por compartir todos sus
conocimientos para sacar este trabajo adelante.
Al Dr. Sal Pearanda por la paciencia y todo su aporte durante el desarrollo del
trabajo.
A todas las personas que de una u otra forma con su colaboracin y amistad
incondicional participaron de la elaboracin de este trabajo.
TABLA DE CONTENIDO
INTRODUCCIN
1. MARCO TEORICO
1.1 ANTECEDENTES
14
14
15
16
1.3.1 Selectividad
16
1.3.2 Especificidad
16
17
1.3.4 Precisin
17
18
1.3.6 Exactitud
19
1.3.7 Estabilidad
19
19
20
1.3.10 Sensibilidad
20
20
23
24
25
26
26
26
27
28
29
1.7.3 Detectores
30
32
33
1.8.2 Acreditacin
36
38
38
2.2 JUSTIFICACIN
39
3. OBJETIVOS
41
41
41
4. MATERIALES Y MTODOS
42
42
42
42
43
43
5. RESULTADOS Y DISCUSIN
45
45
51
6. CONCLUSIONES
55
7. RECOMENDACIONES
56
8. REFERENCIAS
57
ANEXOS
ANEXO
1.
GUIA
PARA
LA
MICROBIOLGICOS ESTNDAR
VALIDACIN
DE
MTODOS
LISTA DE FIGURAS
FIGURA
TITULO
PAG
48
65
Procesamiento de la Muestra
77
LISTA DE TABLAS
TABLA
TITULO
PAG
45
Acreditaciones 2008-2012
47
49
RESUMEN
Para llevar a cabo esta gua, se realiz una extensa revisin y recopilacin
bibliogrfica para obtener la mayor informacin posible sobre cmo validar tcnicas
microbiolgicas y poder abstraer un modelo preliminar de validacin de los ensayos
estndar que se realizan en microbiologa. A partir de la bsqueda, se inicio una
comparacin de toda la informacin obtenida para disear el protocolo. Despus de
la obtencin del esquema prctico que incluye desde la toma de la muestra (muestreo)
hasta el procesamiento de la misma, se procedi a la consulta y diseo de un modelo
estadstico preliminar para determinar parmetros y variables a tener en cuenta para
llevar a cabo una validacin.
Como resultado se obtuvo una gua en donde de forma clara, prctica y concisa se
orienta a la aplicacin de conceptos bsicos de la microbiologa estndar y
herramientas estadsticas para determinar variables preliminares para la validacin de
un ensayo estndar en microbiologa.
INTRODUCCION
por
1. MARCO TERICO
1.1 ANTECEDENTES
Se requieren mtodos analticos fiables para cumplir con las normativas nacionales e
internacionales en todas las reas de anlisis. Por lo tanto, est admitido
internacionalmente que un laboratorio deba tomar las medidas pertinentes para
asegurarse de que es capaz de producir, y de que lo hace efectivamente, datos con el
nivel necesario de calidad. Dichas medidas comprenden:
Otros aspectos de lo anteriormente dicho han sido tratados por el Grupo de Trabajo
Interdivisional de la IUPAC sobre Armonizacin de Mtodos de Garanta de Calidad
para Laboratorios Analticos, en particular mediante la elaboracin de protocolos
sobre los estudios de rendimiento de los mtodos, ensayos de aptitud, y control
interno de calidad (OENO, 2005).
10
11
Por otro lado, se deben tener en cuenta algunos requisitos relacionados con el proceso
de trazabilidad, tales como la confirmacin de qu tan adecuada es la especificacin
del mtodo. La validacin del mtodo debe suministrar una prueba razonable de la
condicin y la ecuacin de medicin. En un caso ideal dentro de un laboratorio
individual incluira las siguientes actividades: (Baracaldo, R)
12
13
14
Por regla general, la validacin secundaria utiliza los mismos modos operativos que
la validacin primaria pero bajo formas seleccionadas y simplificadas, aunque
posiblemente extendidas a lo largo de un periodo de tiempo mayor. Las muestras
naturales son los materiales de ensayo ptimos y el trabajo necesario se refiere
exclusivamente a que el modo operativo se inscriba dentro de los lmites
operacionales definidos en la validacin primaria. (WHO Technical Report Series,
No. 823, 1992).
Para llevar a cabo una validacin se debe tener clara la metodologa analtica, la cual
va de lo general a lo particular, se inicia con la valoracin de la tcnica, que es el
principio cientfico que puede ser til para suministrar informacin sobre la
composicin de una muestra; seguida del mtodo que es la adaptacin de la tcnica
para un propsito especfico, que para ser utilizado correctamente debe ir descrito en
un procedimiento y finalmente a partir de la informacin recopilada se obtiene el
protocolo en donde se suministran una serie de direcciones precisas y definitivas que
15
1.3.1 Selectividad Un mtodo selectivo aporta resultados exactos para todos los
analitos de inters, mientras que uno especfico produce resultados exactos para un
analito, al tiempo que los otros analitos de inters pueden interferir los unos con los
otros. (WHO Technical Report Series, No. 823, 1992).
1.3.2 Especificidad
16
17
- Reproducibilidad
18
19
1.3.10. Sensibilidad
20
21
normas oficiales vigentes tales como la ISO-NTC 17025. (ROMERO, Maria., et al,
2003).
Para decidir si un mtodo es apropiado o no, se debe tener en cuenta: si ese mtodo es
aplicable al analito a analizar, la cantidad de muestra necesaria para el ensayo, el
lmite inferior del mtodo (para ensayos cuantitativos), si usando esta metodologa se
puede evaluar el cumplimiento de las exigencias requeridas para el analito. Cuando el
muestreo es llevado a cabo por el laboratorio, este debe usar procedimientos
documentados y tcnicas estadsticas apropiadas para seleccionar las muestras. (Ver
Captulo 6. Muestreo. Requisitos de la Norma 17025). La precisin, la especificidad,
22
Es necesario aplicar dos mtodos en paralelo sobre las mismas muestras cuando se
est desarrollando un mtodo interno, y tambin cuando se est recopilando
informacin justificativa del uso de un mtodo alternativo (ISO/ TR 13843:2000).
23
Las diferencias debidas a las matrices deben tenerse muy en cuenta al analizar
diferentes tipos de muestras. Los resultados deben evaluarse utilizando mtodos
estadsticos apropiados. (Cuesta, A).
Debe considerarse la
24
Los errores asociados a las mediciones pueden dividirse en dos grandes clases: a)
errores sistemticos, y b) errores aleatorios. Los errores sistemticos, tal como su
nombre lo indica, se cometen de una misma manera cada vez que se mide. Muchos
errores sistemticos pueden eliminarse aplicando correcciones muy simples. Estos
errores son llamados tambin errores corregibles o determinados, a fines de
distinguirlos de los errores aleatorios, los cuales se encuentran en toda medicin y
estn fuera del control del observador.
25
26
catalogados
muy caracterizados
de origen conocido
27
Para ser convincente, el nmero y variedad de las muestras a examinar debe ser
suficiente. Sin la ayuda de la estadstica no hay ninguna manera de precisa de tomar
una decisin. En ciertos casos, la primera muestra estudiada puede indicar ya que el
mtodo no es suficientemente bueno. Pero, una sola muestra generalmente no basta.
A veces, se necesita un millar de muestras para demostrar que dos mtodos P/A no
son equivalentes. Seleccionar una cantidad insuficiente de ejemplos puede constituir
una prdida de tiempo.
28
La variacin aleatoria debido a una muestra no homognea de las partculas entre dos
muestras paralelas, incluso en suspensiones perfectamente mezcladas, es una
caracterstica de los mtodos microbiolgicos. La variacin aleatoria bsica es
inevitable y no tiene nada que ver con la competencia tcnica o con el equipamiento.
Esta variacin obedece a una ley matemtica conocida, la distribucin de Poisson, y
por lo tanto puede calcularse.
1.7.2 Material de Ensayo Est generalmente aceptado que la validacin debe simular
en la mayor medida posible el proceso de rutina. Por lo tanto, las muestras naturales
con concentraciones naturales de microorganismos deberan ser los principales
materiales de ensayo. Hay excepciones en algunas circunstancias concretas. Los
materiales artificiales (materiales de referencia certificados y muestras enriquecidas)
se utilizan en sistemas de aseguramiento de la calidad internos y externos para
asegurar la competencia tcnica bsica de los laboratorios que participan en los
ejercicios de validacin de mtodos. (ISO/TR 13843:2000).
29
30
31
1.8.
ANLISIS MICROBIOLGICO
32
El intervalo entre estos controles depender del diseo del programa y del nmero de
ensayos realizados. Es recomendable que, en la medida de lo posible, los ensayos
incluyan controles para evaluar sus resultados. En circunstancias especiales, un
laboratorio puede estar acreditado para realizar un ensayo que rara vez se demanda.
Se reconoce que, en tales casos, un programa continuo de control interno de la
calidad no siempre ser apropiado, siendo preferible un sistema que se realice en
paralelo al ensayo y que demuestre que los resultados son satisfactorios. (G-ENAC04).
33
Cada
microorganismo
individual
reacciona
con
el
medio
nutritivo
casi
34
Los estudios que sobre materiales homogneos en los que participan, de forma
colaborativa, varios laboratorios se consideran ensayos esenciales para el
funcionamiento del mtodo, pero tambin para el de los propios laboratorios. (Una
vez identificados y eliminados los valores rechazables, se considera que los restantes
datos aportan la informacin necesaria sobre el funcionamiento y la eficiencia del
mtodo). Hoy en da, los estudios colaborativos, constituyen una herramienta de
amplia aplicacin para evaluar las caractersticas de precisin de los mtodos
qumicos. Parece algo prematuro recomendar la puesta en prctica de este tipo de
ensayos en microbiologa. Se admite en efecto, que todos los laboratorios
35
Mtodos equivalentes
36
37
38
2.2 JUSTIFICACIN
Con el desarrollo de la gua se pretende facilitar a los laboratorios que llevan a cabo
pruebas microbiolgicas la validacin de estas, orientndolos de forma clara y
sencilla en la consecucin de los objetivos de la ISO 17025, ya que con ello se
sustenta el hecho de presentar al cliente o a la persona interesada resultados
confiables que permitan al mismo tomar decisiones. Se sustenta al mismo tiempo, que
los procedimientos de validacin dar lugar a un sin nmero de beneficios, entre los
cuales est el poder garantizar la competencia de las tcnicas realizadas en dichos
laboratorios, el logro y mantenimiento de la calidad de los servicios ofrecidos por
estos, apertura de nuevas oportunidades de mercado, obtencin de reconocimiento y
39
de esta forma aumento de la credibilidad y confianza por parte del cliente, as como
competitividad, calidad y garanta de bienestar social, debido al logro de la
sensibilizacin del personal, el uso de equipos e instrumentos adecuados,
conocimiento de diferentes requisitos normativos, entre otros.
40
3. OBJETIVOS
41
4. MATERIALES Y MTODOS
4.1.
TIPO DE INVESTIGACIN
4.3.
42
Luego del anlisis de las referencias bibliogrficas se pudo deducir que los
modelos lineales de la estadstica paramtrica no permiten entender de forma
adecuada el crecimiento microbiano debido a la heterogeneidad que este presenta
como consecuencia del sistema fsico, bioqumico y micro-ecolgico de la
muestra. Debido a esto se hizo necesario profundizar ms en otros mtodos
estadsticos que permitieran cuantificar las observaciones realizadas en
microbiologa estndar con el fin de expresarlas cuantitativamente.
43
44
5. RESULTADOS Y DISCUSIN
Internacional
-ISO/TR 13843-2000
-ISO/TS 11133-1
-G-ENAC-4
de Aguas:
45
Downloaded
from
http:
//64.55.218.151/pubs/storyarchives/cutlabs.htm. 8/28/2003
Para dar cumplimiento a las polticas planteadas en cuanto a calidad se han venido
brindando los siguientes marcos regulatorios: El estatuto de Proteccin al
Consumidor y El Sistema Nacional de Normalizacin, Certificacin y Metrologa
(SNNCM) a cargo de la Superintendencia de Industria y Comercio (SIC) (Crubellati,
R. 2005). Esta superintendencia es la entidad que acredita a los organismos
evaluadores de la conformidad que operan dentro del SNNCM, el cual de acuerdo
con los lineamientos establecidos en el CONPES 3446 del 30 de octubre de 2006, se
ir transformando en el nuevo Subsistema Nacional de la Calidad. (Organismo
Nacional de Acreditacin, 2007)
46
2008
2009
2010
2011
2012
Organismos de Certificacin
Organismos de Inspeccin
20
Laboratorios de Ensayo
10
13
14
16
18
Laboratorios de Calibracin
11
12
Laboratorios Ambientales
Total
13
27
37
43
49
47
referencia,
contrarreferencia,
control
de
calidad,
capacitacin,
R E D D E L AB O R AT O R IO S
1 20
C LIN IC O S
A LIM E N TO S
C ITO P A TO LO G A
TA M IZA JE N E O N A TA L
TO XIC O LO G A
1 00
104
82
85
80
54
60
60
35
40
20
20
20
20
22
20
40
25 25
8
0
19 89
19 98
2 000
48
2 00 1
200 2
200 3
Fuente: Secretara Distrital de Salud: Prospectiva del Laboratorio Distrital de Salud Pblica, 2003
Tambin se determin en conjunto con los diferentes grupos de trabajo y a la luz del
decreto 475 sobre vigilancia de la calidad del agua, establecer con claridad un
muestreo adecuado en las pruebas analticas de agua, disminuyendo de 9000 a un
promedio de 6000 por ao, que garantiza la vigilancia adecuada de la calidad de agua
de consumo humano (Secretara Distrital de Salud: Prospectiva del Laboratorio
Distrital de Salud Pblica, 2003).
1998
1999
2000
2001
2002
Aguas
6668
9933
6039
6005
5501
Mayor Riesgo
6867
10641
3591
1816
3094
49
Menor Riesgo
6042
Bebidas alcohlicas
823
Control Especial
1714
1244
298
202
413
892
822
1272
642
553
1377
410
457
181
181
Control de Calidad
Medicamentos
217
55
Microbiologa Ambiental
Total
11
22114
22035
11517
9989
12306
50
5.2.
MODELO
MATEMTICO
PRELIMINAR
BSICO
PARA
LA
Esta gua plantea metodologas no solo matemticas sino practicas ya que especifica
adems, la toma de la muestra, el nmero de muestras tomadas, el mtodo de
muestreo, entre otras variables que podran o no afectar los resultados de la
validacin de un mtodo microbiolgico, en caso que no se obtengan resultados
51
repercuten
directamente en la salud tanto humana como animal, los mtodos de ensayo, como
los laboratorios que realizan los anlisis deben asegurar los resultados fiables, lo cual
implica que adems de reunir los aspectos tcnicos que aseguren su validez, se deben
poder reproducir
Para dar cumplimiento al propsito establecido por la ISO/IEC 17025 segn la cual
la validacin es la confirmacin, a travs del examen y el aporte de evidencias
objetivas, de que se cumplen los requisitos particulares para un uso especfico
previsto, se hace necesario el conocimiento de las caractersticas de funcionamiento
del mtodo teniendo en cuenta que la validacin de los mtodos microbiolgicos no
puede realizarse igual a la de mtodos fsicos o qumicos debido a la variabilidad que
se puede presentar. Sin embargo, un laboratorio que realice actividades de control de
calidad interno y adems participe en actividades interlaboratorios que lleven a cabo
comparaciones, est en la capacidad de obtener informacin sobre las caractersticas
de funcionamiento de los mtodos.
52
a travs de las
referencias consultadas que por la dificultad del tema no es fcil que las personas
involucradas en procesos microbiolgicos se comprometan con el tema de la
validacin, a pesar de saber que para garantizar los resultados obtenidos en los
anlisis, se debe contar con metodologas, materiales y personal validado. Debido a
que los laboratorios se han preocupado nicamente en implementar metodologas
aceptadas por entes nacionales e internacionales, se ha olvidado el hecho de
comprobar si el mtodo es capaz de alcanzar su rendimiento segn las publicaciones
realizadas por estos entes (o si es capaz de cumplir los requisitos de las tareas
analticas). El laboratorio debe realizar estudios de validacin de esas metodologas
publicadas en las condiciones y ambiente en las que se desarrollan sus actividades:
EL LABORATORIO DEBE UTILIZAR UN MTODO BIEN ESTABLECIDO,
PERO NO ESTUDIADO DE FORMA COLECTIVA (OENO, 2005) (AOAC
INTERNATIONAL, 2003), ya que el desempeo de los materiales, del personal y en
si de las pruebas de ensayo puede variar. Por ello lo que propone la gua debe ser
implementado y probado en las condiciones en las que se realizan normalmente los
ensayos, por lo que la comparacin de los resultados de un laboratorio que ha
validado sus pruebas, no puede llevar al hecho de asumir los mismos resultados en
otro laboratorio.
Para seguir la metodologa planteada por esta gua se discute tambin no solo la
competencia de las condiciones ambientales sino tambin de los materiales, as como
la ms crtica y de gran importancia, la competencia tcnica para desarrollar las
metodologas fuera y dentro del laboratorio (Cuesta, Alicia).
53
54
6. CONCLUSIONES
55
7. RECOMENDACIONES
Validar
56
8. REFERENCIAS
for
Collaborative
Study.
Downloaded
from
http://64.55.218.151/pubs/storyarchives/cutlabs.htm. 8/28/2003
57
Facultad
de
Ciencias.
Microbiologa
Industrial.
Pontificia
58
GARCIA, Ana.,
Franklin. 2005.
59
SOTOLONGO,
USECHE,
Blanca.
Herramientas
estadsticas.
Instituto
de
Hidrologa,
60
RECURSOS ELECTRNICOS
http://www.sic.gov.co/Articulos_Pagina_Principal/Conferencias/2006/Sistema_Nacional_
Normalizacion.pdf. SISTEMA NACIONAL DE NORMALIZACIN, CERTIFICACION
Y
METROLOGIA
BASE
PARA
EL
FORTALECIMIENTO
DE
LA
http://www.ideam.gov.co/temas/calidad/Descripci%C3%B3n%20Gral.%20Norma%20ISO
-IEC%2017025.pdf Noviembre 2006
http://www.zmk-wolfen.de/esp/esp_servicios_cal_inform.htm.
Manual
de
Laboratorio
para
fsica
http://arfiexp.tripod.com/manual_de_laboratorio2.htm.
61
C,
versin
2002.
En
lnea:
62
63