Incidencias y Mantenimiento en HPLC PDF
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INTRODUCCIN ................................................................................................................... - 4 -
EL CROMATGRAFO LQUIDO BSICO ....................................................................... - 6 2.1 VOLUMEN EXTRA EN COLUMNA(V0) .......................................................................................... - 9 2.2 CRITERIOS PARA UN MANTENIMIENTO LGICO .................................................................... - 11 2.3 REGLAS DE ORO EN EL DIAGNSTICO DE AVERAS ............................................................... - 12 2.4 PROBLEMAS TPICOS EN HPLC ............................................................................................. - 12 -
COMPATIBILIDAD DEL DISOLVENTE Y EQUILIBRADO DEL SISTEMA ...................................... - 14 PREPARACION DE LA FASE MOVIL.............................................................................................-19
DESGASIFICACIN DE LA FASE MVIL .................................................................................. - 33 FILTRACIN DE LA FASE MVIL ........................................................................................... - 40 -
FUNCIONES DE LA BOMBA .................................................................................................... - 46 BOMBA RECPROCA DE PISTN SIMPLE ................................................................................ - 47 LA BOMBA RECPROCA DE DOBLE PISTN ........................................................................... - 49 LA BOMBA BINARIA DE GRADIENTE ..................................................................................... - 50 LA BOMBA CUATERNARIA DE GRADIENTE ........................................................................... - 51 FORMACIN DE GRADIENTES Y TIEMPO MUERTO (DWELL-TIME) .................................... - 52 INCIDENCIAS DE LA BOMBA .................................................................................................. - 55 -
COMPONENTES DEL SISTEMA DE INYECCIN ........................................................................ - 65 AUTOMUESTREADORES ......................................................................................................... - 71 INCIDENCIAS DEL AUTOMUESTREADOR ................................................................................ - 76 -
6.2
INCIDENCIAS DE LA COLUMNA........................................................................................................................-90-
7. PICOS CON COLA .................................................................................................................... - 96 8. PICOS CON FRENTE .............................................................................................................. - 101 TUTORIAL 2 ................................................................................................................................. - 102 9
EL DETECTOR IDEAL ........................................................................................................... - 104 EL DETECTOR UV/VISIBLE ................................................................................................. - 107 INCIDENCIAS Y MANTENIMIENTO DEL DETECTOR UV/VISIBLE .......................................... - 109 PICOS NEGATIVOS............................................................................................................................................-114EL DETECTOR DE LIGHT SCATTERING EVAPORATIVO ......................................................... - 116 EL DETECTOR ESPECTROMTRICO DE MASAS ..................................................................... - 118 -
TUTORIAL 3 ................................................................................................................................. - 125 10.1 LNEAS DE BASE ................................................................................................................ - 128 10.1.1 LNEAS DE BASE ERRTICAS ............................................................................................. - 128 10.1.2
LNEA DE BASE CCLICA (CORTA FRECUENCIA) ........................................................ - 130 10.1.3
LNEA DE BASE CCLICA (LARGA FRECUENCIA)........................................................ - 133 10.1.4
LINEAS DE BASES CON DERIVA ................................................................................. - 136 10.1.5
LNEAS DE BASE CON RUIDO ..................................................................................... - 138 10.2 FORMAS DE PICO .............................................................................................................. - 140 10.2.1
ENSANCHAMIENTO DE LOS PICOS .............................................................................. - 140 10.2.2
DESDOBLAMIENTO DE PICOS Y HOMBROS ................................................................. - 143 10.2.4
PICOS CON FRENTE .................................................................................................... - 151 10.2.5
EFECTO MEMORIA Y PICOS FANTASMA ..................................................................... - 152 10.2.6
PICOS NEGATIVOS ..................................................................................................... - 154 10.3 TIEMPO DE RETENCIN..................................................................................................... - 156 Traduccin Grupo Biomaster 2009
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TIEMPOS DE RETENCIN FLUCTUANTES .................................................................... - 156 DECRECIMIENTO DEL TIEMPO DE RETENCIN ........................................................... - 160 AUMENTO DEL TIEMPO DE RETENCIN ..................................................................... - 162 INCIDENCIAS CON LA PRESIN .................................................................................. - 162 SENSIBILIDAD............................................................................................................ - 166 -
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Introduccin
del
curso
de
incidencias y
observando
los
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Botellas de Disolvente
Los disolventes que conforman la fase mvil estn contenidos en botellas
que generalmente se encuentran en la parte superior del sistema HPLC.
Dicha disposicin mejora su suministro, ya que se consigue un descenso
natural de la fase lquida por efecto sifn bajo influencia de la gravedad.
Las botellas de los disolventes deben estar cerradas hermticamente a fin
de prevenir la prdida de solventes orgnicos por evaporacin, aunque
siempre debe existir una pequea abertura para evitar la formacin de vaco
Traduccin Grupo Biomaster 2009
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Desgasificador
La eliminacin de gases disueltos en la fase mvil ayuda a prevenir la
formacin de burbujas en el sistema HPLC. Burbujas de aire en la bomba
pueden provocar prdida de eficacia en el cebado de sta, errores en la
formacin de gradientes de disolventes y ruido en la lnea de base debido a
fluctuaciones en la presin. Las columnas del HPLC pueden perder
rendimiento si circulan burbujas de aire a travs de estas debido a la
formacin de canales por presin, estos se saturarn rpidamente con
molculas de analito lo que har perder capacidad de retencin de la
columna por perdida de superficie activa. Las burbujas de aire formadas por
desgasificacin en la celda del detector pueden contribuir al ruido de la
lnea de base, lo que reduce los lmites de deteccin esperados y/o los
lmites de cuantificacin.
Bomba HPLC
La bomba del HPLC, o sistema de suministro de disolvente, es la responsable
de conseguir una composicin exacta de la fase mvil a velocidades de flujo
constantes y proporcionar la fuerza necesaria para el transporte de dicha
fase a travs del relleno de la columna. Lo ideal sera que la bomba no
produjese impulsos impredecibles en la presin, por ello la mayora de los
sistemas acostumbran a estar dotados de un mecanismo integrado de
amortiguacin para la presin (Damper) que ayuda a corregir dicho efecto.
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Automuestreador
Es necesario un sistema automatizado que inyecte la muestra en cabeza de
columna del HPLC, sin detener o distorsionar el flujo de la fase mvil.
El muestreador automtico debe minimizar el efecto memoria del analito
entre inyecciones, e incrementar la productividad gracias a funciones
adicionales tales como la capacidad de derivatizar la muestra antes de la
columna, adicin de soluciones de estndar interno, etc
Columna
La separacin cromatogrfica de los componentes de la muestra tiene lugar
a travs de la interaccin especfica entre el analito y la fase estacionaria
de la columna. Para largos periodos de tiempo entre usos, la columna del
HPLC debe almacenarse en condiciones correctas. Las columnas no deben
ser sometidas a excesivo estrs fsico, as como a golpes o cadas, que
pueden alterar el relleno de la fase estacionaria empobreciendo su
rendimiento. Para minimizar variaciones en los tiempos de retencin
absolutos es habitual termostatizar la columna a fin de evitar los efectos
fluctuantes de la temperatura ambiente.
Detector
Existe una gran variedad de detectores, aunque debido a su costo, robustez,
lmites de deteccin y facilidad de uso, el detector ms utilizado es el de
absorbancia UV. Los detectores UV estn disponibles en una sola longitud de
onda, mltiples longitudes de onda o en configuracin de diodo array, que
por su capacidad de analizar la de pureza de picos y de realizar bsquedas
frente a bibliotecas de espectros UV ha llegado a ser muy popular.
Para anlisis que requieran alta sensibilidad y selectividad es preferible el
uso de detectores de fluorescencia, electroqumicos o espectrmetros de
masas. Los detectores de ndice de refraccin son solo aconsejables si el
resto de detectores no son aplicables o si la concentracin del analito es
alta.
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Perspectiva Sintomtica
Este enfoque en la identificacin de problemas se refiere especficamente a
los efectos que el analista puede ver. Generalmente incluye un examen
visual de la lnea de base o de la forma y/o apariencia de los picos
cromatogrficos a fin de encontrar indicios de problemas en la selectividad
de la separacin o en los componentes del sistema.
Variaciones en los tiempos de retencin, cambios en la presin del sistema,
perdidas de sensibilidad o en las recuperaciones del analito, se pueden
estudiar a travs de ambas perspectivas.
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2.
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Picos
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La Fase Mvil
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Ejemplo de una lnea de base con deriva (figura superior) y una lnea de
base errtica (figura inferior) que pueden verse en un sistema no
equilibrado
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Fase mvil
Elimina de la columna todos los analitos retenidos.
H2O
Cualquier tampn usado debe ser reemplazado solo con agua, por
ejemplo, en una separacin isocrtica con 50:50 MeOH:50mM de
KH2PO4, entonces los 50mM de KH2PO4 deben ser intercambiados por
H2O y el sistema deber ser purgado adecuadamente.
H2O
Retirar la columna del sistema y purgar solo con H2O al 100% para
eliminar todas las posibles trazas de sales tampn.
Isopropanol
Isopropanol:Hexano (u otros disolventes no localizadores(*)) 50:50
Elucin en Fase Normal
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6.
7.
8.
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- 19 -
- 20 -
10
9
8
O
R C O
H
Weakly Basic
6
5
Weakly Acidic
3
2
1
0
pH = pK
O
R C
O
pH
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Fuerza Tamponadora
El cromatograma siguiente muestra el efecto de un cambio en la fuerza
tamponadora durante una separacin isocrtica de seis aditivos
alimentarios; cido ascrbico, sorbato potsico, benzoato sdico, vainillina,
cumarina y etil-vainillina, picos del 1 al 6 respectivamente.
El primer cromatograma muestra la separacin de seis analitos mediante un
tampn de concentracin 60mM. La pareja de picos 4 y 5 se separa con una
resolucin de 1.65, separacin suficiente para poder cuantificarlos.
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Balanza de 6 decimales
MAQ (FAL = 0.1%) = 1mg
Balanza de 4 decimales
MAQ (FAL = 0.1%) = 100mg
Balanza de 3 decimales
MAQ (FAL = 0.1%) = 1g
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Semi-micro analtica
Micro analtica
Peso Mximo
Tolerancia
(g)
(mg)
3,200
10
5,200
10
8,200
100
60
0.015
230
0.025
2.1
0.00025
5.1
0.0010
21
0.0020
Fuentes de Deriva
La precisin en la medida del peso con la balanza analtica puede sufrir
deriva. Las fuentes de deriva incluyen:
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Efectos Estticos
El mecanismo por el que la balanza percibe el peso mediante sensores de
presin y sus sistemas electrnicos internos, pueden alterarse
sustancialmente por la electricidad esttica de los envases o recipientes, as
como la carga de las muestras o las sustancias que estn siendo pesadas. Los
contenedores de vidrio plstico son particularmente susceptibles a este
efecto ya que la densidad de la carga no se elimina fcilmente debido a su
baja conductividad. El ltex y los guantes de plstico son tambin conocidos
transmisores de carga electrosttica al plato de las balanzas.
Las balanzas afectadas por electricidad esttica presentan generalmente
problemas de lecturas muy inestables o derivas continuas.
Hay varias recomendaciones a seguir para contrarrestar este efecto:
Muestras Higroscpicas
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Muestras Voltiles
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Efectos de la Temperatura
El pH Metro y el Ajuste de pH
El pH es uno de los parmetros ms comnmente determinados en
soluciones tanto acuosas como no acuosas. Variaciones en el pH pueden
provocar cambios significativos en la velocidad de reaccin as como
cambios en la solubilidad y biodisponibilidad de muchos principios activos
con fines farmacuticos. Como se ha descrito anteriormente, las
caractersticas en la retencin de muchas especies de analitos pueden
cambiar por variaciones en el pH de la fase mvil y por tanto contribuir a
formas de picos anormales, es decir, desdoblamientos y colas.
El pH es un parmetro que indica la acidez o alcalinidad de una solucin, se
mide en una escala de 0 a 14, donde un valor de pH igual a 0 es muy cido
y un valor de 14 es muy bsico. El pH mide la concentracin, o ms
exactamente la actividad del Ion oxonio H3O+, aunque en la solucin el Ion
oxonio est representado como un protn o Ion hidrgeno, H+.
Generalmente se ajusta primero el pH del disolvente de la fase mvil antes
de aadir el volumen de disolvente orgnico necesario. Este enfoque
sistemtico asegura exactitud en la concentracin del Ion oxonio. Para
asegurar homogeneidad mientras se adiciona el reactivo en el ajuste del pH,
la solucin puede ser agitada en una placa magntica, aunque se debe
evitar calentamientos que puedan afectar la composicin del disolvente.
El reactivo para ajustar el pH puede aadirse gota a gota usando material
plstico, vidrio o pipetas dispensadoras automticas.
El empleo de vidrio propicia la introduccin de iones metlicos. Los iones
Al3+ y Fe2+ inducirn actividad en los grupos silanol residuales de la columna
analtica. La consecuencia de esto es la observacin de colas en los picos
Traduccin Grupo Biomaster 2009
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Determinacin del pH
El sistema de medicin del pH consta de tres componentes:
Un electrodo de pH.
Un electrodo de referencia.
Un pH metro de alta impedancia.
Electrodo de Referencia
El electrodo de referencia consiste en un cable de plata recubierto en
cloruro de plata, una solucin de relleno y una junta permeable
(generalmente fritas de cermica o membranas), a travs del cual la
solucin de relleno migra lentamente dentro de la muestra que est siendo
medida. En algunas partes de la frita apenas hay flujo neto de la solucin de
relleno, dicha regin se llama junta de difusin.
Electrodo de pH
El electrodo de pH est hecho de un vidrio de composicin especial, que es
sensible a la concentracin de iones hidrgeno. Dicho vidrio est compuesto
generalmente por un metal alcalino que sostiene una reaccin de
intercambio de iones con los Iones hidrgeno de la solucin test para
generar una diferencia de potencial.
Electrodos de pH Combinados
Los electrodos combinados contienen los dos electrodos descritos
anteriormente en un nico cuerpo de vidrio. El potencial generado en la
zona de unin se debe a los iones libres de hidrgeno presentes en la
muestra. El potencial de referencia es generado por un elemento interno
de Ag/AgCl que est en contacto con la solucin relleno de referencia. El
electrodo de medida emite un voltaje variable y el electrodo de referencia
un voltaje constante para el medidor.
El sistema funciona de manera anloga a la medida del voltaje de una
batera por un voltmetro. El cable interior del electrodo de pH tiene la
misma finalidad que el primer cable que va desde la batera hasta el
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Electrodo de pH
Combinado ROSS
Bulbo detector de pH
El pH-metro
El electrodo de pH tiene una resistencia interna muy alta, haciendo muy
difcil la medida de los pocos milivoltios de salida que provocan los cambios
de pH. Un pH-metro es bsicamente un amplificador de alta impedancia que
mide con precisin los diminutos cambios de voltaje del electrodo,
mostrando el resultado directamente en unidades de pH o en milivoltios.
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Volumtrica
del
Tiempo de Retencin
Factor de Capacidad
(min)
k'
60
5.40
2.72
62*
4.82
2.32
58**
5.87
3.05
(%)
* 40mL de H2O llevados hasta 100mL con 60mL MeOH, Calculado el k'
** 60mL de MeOH llevados hasta 100mL con 40mL H2O, Calculado el k'
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Mtodos de Desgasificacin
Hay cuatro modos aceptados para desgasificar la fase mvil:
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En discontinuo
Incidental
Desgasificacin en lnea
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Ultrasonidos
Este es el menos eficiente de todos los mecanismos de desgasificacin ya
que solo elimina aproximadamente el 30% de los gases disueltos. La fase
mvil se desgasifica por sonicacin de forma que los gases disueltos se
aglomeran formando burbujas con el suficiente tamao para flotar hasta la
superficie del lquido. Dicha tcnica es limitada, pues se lleva a cabo fuera
del sistema y el calor generado en el proceso de sonicacin puede provocar
la prdida de los compuestos ms voltiles de la fase mvil por evaporacin
selectiva. Sus limitaciones se compensan generalmente por sus ventajas en
simplicidad y bajo coste.
En consecuencia el ultrasonidos no es muy recomendable y si es usado debe
serlo durante el mnimo tiempo posible y preferiblemente con un bao de
agua que controle la temperatura.
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Crecimiento microbiolgico
Los disolventes contaminados o el crecimiento microbiano en las botellas de
disolvente, pueden taponar los filtros y perjudicar al funcionamiento de la
bomba. El crecimiento microbiano tambin puede bloquear el
automuestreador, provocando variaciones en los volmenes inyectados o
recubriendo las ventanas de la celda de flujo provocando as lneas de base
errticas y reduciendo la sensibilidad.
cido clorhdrico
cidos inorgnicos y cidos fuertes
Haluros Bsicos (Cloruro de Sodio, Ioduro de Litio)
Tetracloruro de Carbono con 2-propanol o THF
Agentes acomplejantes (EDTA, cido ctrico, cido actico)
Ataque al cuarzo y vespel
Si se usan los compuestos anteriores ser necesario un mantenimiento ms frecuente del HPLC.
Cuando se usen, al finalizar el anlisis la bomba u otros componentes del HPLC deben ser purgados a
fondo.
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Sistemas de bombeo
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Principio de Operacin
Las vlvulas antirretorno (Check-Valves) vlvulas de Bola y Asiento
estn diseadas para permitir nicamente un flujo unidireccional de fase
mvil. La bola, hecha de un material qumicamente inerte como el rub,
se asienta en un asiento de zafiro sinttico.
En funcin de la posicin del pistn en un determinado momento la bola se
encuentra situada directamente contra el asiento, deteniendo de forma
efectiva el flujo de la fase estacionaria, o suspendida en el cuerpo principal
de la vlvula, donde ofrece poca resistencia al flujo de la fase mvil,
permitiendo su paso al sistema de HPLC.
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Principio de Operacin
Este diseo de la bomba es muy eficiente, porque mientras un pistn se est
llenando con fase mvil, el segundo pistn est entregando fase mvil al
sistema de HPLC. Este desfase de 180 en el funcionamiento del pistn
produce un flujo de fase mvil virtualmente libre de picos, y permite gran
reproducibilidad en gradientes de fase mvil. Este diseo se utiliza a
menudo junto con un amortiguador de pulsos, para obtener la menor
fluctuacin de presin posible durante la dispensacin de la fase mvil.
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Efectos de Cavitacin
Durante la mezcla de disolventes en la vlvula proporcional pueden
generarse burbujas. Esto es debido a que los gases disueltos tienen
menor solubilidad en la mezcla final que en los solventes iniciales.
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2.
3.
4.
5.
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No sustituir la frita puede dar como resultado una lnea de base errtica
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El material del sello del Pistn puede ser arrastrado hasta bloquear la frita
y la parte superior de la columna analtica. Los bloqueos en este punto
retrasan la entrada de los analitos en la columna, produciendo picos no
uniformes con hombros. Este tipo de picos tambin pueden originarse por
otro tipo de anomalas, pero una frita de columna bloqueada, a menudo
provocar hombros en todos los picos cromatogrficos
Una frita de Columna bloqueada por restos del sello de los pistones
produciendo picos con hombro
Pistn y Sellos
Los sellos del Pistn estn diseados para desgastarse con el uso, siendo su
vida til muy dependiente del tipo y de la concentracin de las fases
mviles tampn que se utilicen.
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Vlvulas Antirretorno
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Tutorial 1
Pregunta 1
Del siguiente listado de componentes selecciona aquellos que contribuyen a
un ensanchamiento de las bandas cromatogrficas, es decir, disminuyen la
eficiencia en un sistema tpico de HPLC
Componente HPLC
Si/No
Tubos de conexin
Filtro de Lnea
Cabezales de la bomba
Guarda-columna
Inyector
Conexiones-uniones
Celda de flujo del Detector
Botellas de disolvente
Columna Analtica
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Pregunta 2
La ilustracin siguiente es el diagrama esquemtico de un cabezal de doble
pistn recproco. Identifica y etiqueta cada componente.
Funcin
Incidencia
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Pregunta 3
Evaluar el problema propuesto en el siguiente cromatograma y sugerir las
posibles causas y cmo podemos corregirlo
Pregunta 1
Observaciones:
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Pregunta 4
Un gas disuelto en la fase mvil puede provocar mltiples problemas
cromatogrficos. Considera stos y completa la siguiente tabla.
Problema Observado
Causa
Accin Correctora
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Inyectores
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- 66 -
- 67 -
- 68 -
1.
2.
3.
4.
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5.2 Automuestreadores
Los automuestreadores son ampliamente utilizados en los laboratorios de
anlisis para aumentar el n de muestras analizadas, mejorar la precisin,
eliminar la necesidad de que haya personal presente para hacer las
inyecciones manuales y reducir los costes laborales asociados al anlisis
rutinario.
Aunque los fabricantes han diseado automuestreadores bajo diferentes
principios y estrategias, todos ellos incluyen cuatro componentes esenciales
que permiten el automatismo mecnico del sistema de inyeccin manual:
1.
2.
3.
4.
5.2.1
Automuestreador
Llenado
de
Extraccin-
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Load
Position
Inject
Position
- 72 -
5.2.2
Automuestreador de Empuje-Llenado
Load
Position
Wash
Step
Inject
Position
- 73 -
5.2.3
2.
3.
- 74 -
Posicin de
Carga
Posicin de
Inyeccin
- 75 -
% del Total
22
17
Problemas mecnicos
14
Posicin de la Gradilla e
Identificacin de la muestra
12
Efecto Memoria
Fugas
Sellos
Prestaciones
Otros
La aguja de muestra
La obstruccin de la aguja de muestra es el problema ms frecuente que
presentan los automuestreadores. Una preparacin adecuada de la muestra
ayudar por lo general a reducir el nmero de problemas creados por
partculas, bien filtrando o centrifugando las muestras antes de su
inyeccin.
Para desbloquear una aguja obstruida se recomienda la siguiente secuencia
de limpieza:
1.
2.
3.
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El Rotor Seal
El Efecto memoria, junto a una mala precisin en areas y alturas, son
indicios de un rotor seal agotado. El rotor seal debe revisarse para buscar
sntomas de desgaste, especialmente un ahondamiento en los microcanales
entre los puertos que puede generar puntos de retencin de muestra
localizados. Estos puntos se limpian en la siguiente inyeccin produciendo
un mini-cromatograma o picos fantasma.
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- 78 -
10L
25L
Fase Mvil
Grande
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Fase Mvil
La mejor situacin posible es que el disolvente de la muestra y la fase mvil
sean iguales, tanto en poder de elucin como en pH. En esta situacin,
debido a la homogeneidad de disolventes, no hay que preocuparse por los
efectos de dilucin.
Sin embargo, el volumen de inyeccin es limitado. La contribucin del
volumen de inyeccin al ensanchamiento del pico cromatogrfico puede
determinarse con la siguiente ecuacin:
Vol. Muestra.Inyectada2 + Vol.PicoColumna2 = Vol.PicoTotal2
Si el pico ms estrecho (p.ej. el primero) fuese de 30 de anchura a lnea de
base, Su volumen de pico en columna (Vol.PicoColumna) a un flujo de 1mL/min
sera igual a,
(1mL/min / 60) x 30 = 500L
En consecuencia, el volumen mximo de muestra que puede inyectarse sin
aumentar el ancho de pico ms de un 1% sera igual a,
Vol.
Vol.
Vol.
Vol.
Vol.
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- 81 -
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Problemas Mecnicos
Una operacin fiable del automuestreador requiere que se mantenga limpio
y se compruebe regularmente su adecuado ajuste. Hay que limpiar
rpidamente todas las salpicaduras de tampones y/o reactivos para prevenir
la creacin depsitos, que pueden corroer o restringir el movimiento del
automuestreador. Por esta razn los viales de muestra nunca deben
rellenarse cerca del autoinyector.
Debe comprobarse peridicamente el alineamiento de la gradilla de
muestras, muchos fabricantes incorporan mensajes de error en sus softwares
para avisar que la gradilla no est o est incorrectamente colocada.
Muy importante, el automuestreador es una parte del sistema HPLC que
debe lavarse exhaustivamente con fase mvil despus de anlisis de
muestras con tampones o fases mviles tamponadas. Reemplazar en primer
lugar el componente tampn de la fase mvil por H2O para eliminar
cualquier depsito de sales potencialmente corrosivas en la vlvula de
inyeccin, aguja del inyector y capilares. Despus, extrayendo la columna si
fuera necesario, lavar con H2O para asegurar que todas las trazas de las
sales del los tampones se eliminan completamente.
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Efecto Memoria
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Fugas
El Aire puede introducirse potencialmente en el sistema a travs de las
paredes permeables de los tubos de PTFE empleados en el automuestreador.
Esto no representa problemas si se utilizan en su lugar tubos de acero
inoxidable o PEEK en la seccin de toma de muestra de la unidad.
Una tuerca conectada o parcialmente apretada en la conexin del loop de
muestra con la aguja de inyeccin puede tambin provocar la entrada de
aire cuando la muestra se succiona desde el vial.
Un cuerpo de la vlvula de inyeccin mal montado, o un componente
sospechoso pueden producir tambin fugas en el cuerpo de la vlvula.
Desmonte la vlvula y vuelva a montarla segn las instrucciones del
fabricante para solucionarlo.
Debido a su creciente complejidad, los inyectores ms caros tienen ms
reas con fallos potenciales, y por lo tanto, mayor mantenimiento. Sin
embargo, tambin disponen de sistemas mejorados de deteccin de fugas
y/o burbujas y una mayor precisin en la inyeccin de volumen variable.
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Columnas
Purga de la Columna
Despus de la Limpieza, la columna debe ser convenientemente purgada
para eliminar cualquier traza de sales (tampones)
y/o aditivos
provenientes de la fase mvil. Estas sales pueden precipitar introduciendo
partculas que causarn bloqueos provocando el aumento de la presin de
trabajo. En ocasiones, algunas sales empleadas como tampones, pueden
ser de naturaleza corrosiva pudiendo provocar daos en la superficie
metlica del interior de la columna si quedasen retenidas en el ella varios
das, generando as un aumento del ruido de lnea de base o incluso
produciendo fugas.
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Almacenamiento de la Columna
La lectura de la documentacin proporcionada por el fabricante de la
columna nos indicar cul es el disolvente apropiado para su
almacenamiento. Si se requiere cambiar de disolvente a otro no miscible
con el que actualmente contiene la columna, deber emplearse un
disolvente intermedio que sea miscible con ambos.
Al desconectar la columna del equipo deben apretarse convenientemente
los tapones para evitar la evaporacin del disolvente de almacenamiento y
el consiguiente secado de la fase estacionaria.
A continuacin se
almacenamiento que
estacionarias con base
del fabricante para
columna.
1.
Sustituya la fase mvil que contiene el tampn por H2O, y cambie a una
composicin idntica de H2O: orgnico a la utilizada en el mtodo de
separacin original. Esta etapa limpia de forma muy eficiente la
columna y el sistema dejndolos libres de cualquier sal de los tampones
que pudiera precipitar.
Por ejemplo, Si la fase mvil es 50mM KH2PO4 y Acetonitrilo 60:40
(v/v), sustituiremos el 60% de tampn KH2PO4 con Agua purgando
abundantemente.
Se recomienda utilizar tpicamente 10 volmenes de columna, aunque
si se han empleado reactivos formadores de pares de iones, pueden ser
necesarios de 30 a 50 volmenes para asegurar la limpieza correcta.
2.
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- 88 -
- 89 -
% de frecuencia
24
Mala reproducibilidad
16
Recuperacin de la muestra
14
Prdida de resolucin
13
Inestabilidad
11
8.1
4.8
Rango de pH
2.0
Baja eficacia
2.0
2.0
Costes
1.7
Otros
1.5
- 90 -
Filtros de Lnea
Una de las causas ms comunes del deterioro de la columna es el aumento
excesivo de la presin de trabajo. Este aumento de la presin se produce
habitualmente por la acumulacin de material particulado en la frita de
entrada a la columna, y una de las formas ms econmicas y efectivas de
aumentar la vida de sta es incorporar un filtro de lnea de alta presin
Traduccin Grupo Biomaster 2009
- 91 -
Guarda Columnas/Discos
Una guarda columna es una columna corta tpicamente de 10-20 mm de
longitud- que contiene la misma fase estacionaria que la columna analtica.
Si se utiliza un sistema de cartuchos, entonces es necesario utilizar un
soporte de cartuchos adecuado. Los discos guarda columna son pequeos
discos fritados que cuando se alojan en su soporte se enroscan directamente
en la columna analtica. En comparacin con un filtro de lnea, una guarda
columna o disco debe utilizarse solamente como filtro qumico, para
asegurar la eliminacin de cualquier material potencialmente retenido o
agresivo evitando as el posterior fallo posterior de la columna analtica.
En algunos casos una guardacolumna puede proporcionar suficiente
proteccin como para eliminar el clean up (preparacin de muestra
previo) de la muestra. Sin embargo, ya que una guarda columna puede
quedar contaminada con una gran variedad de materiales fuertemente
retenidos, es un requisito obligatorio que cuando se lave con un disolvente
fuerte se haga sin conexin con la columna analtica, evitando as que las
- 92 -
- 93 -
2.
3.
- 94 -
Sustitucin de la Columna
Poniendo en prctica las recomendaciones detalladas hasta ahora podremos
incrementar apreciablemente la vida de las columnas pero en definitiva
stas deben considerarse como materiales consumibles. La duracin de una
columna viene determinado por un gran nmero de factores interrelacionados, p.ej. Tampones y su pH, limpieza de muestra, etc, pero
habitualmente un rango entre 500-2000 inyecciones puede considerarse
aceptable.
- 95 -
- 96 -
Trimetilclorosilosano (TMCS)
Hexametildisilazano (HMDS)
- 97 -
- 98 -
- 99 -
- 100 -
8.
- 101 -
Tutorial 2
Pregunta 1
Usando la tabla siguiente enumere cinco partes del Automuestreador de
Loop completo que pueden requerir mantenimiento rutinario.
Indique la principal incidencia que puede presentar cada una de los
componentes enumerados y cul sera la solucin ms adecuada para
remediarla.
Componente
Incidencia
Solucin
- 102 -
Pregunta 2
A continuacin se muestran dos cromatogramas que pueden o no darnos
informacin sintomtica del status operacional del sistema HPLC.
Indique que acciones pueden ser necesarias para mejorar la cromatografa
obtenida. Rellene sus respuestas empleando la tabla incluida.
Condiciones:
Muestra:
Columna:
Flujo:
Fase Mvil:
Vol Inyeccin:
Deteccin:
Incidencia
Solucin
- 103 -
Detectores
Ser igual de sensible para todos los picos eluidos o registrar nicamente
aquellos picos que sean de inters.
No ser afectado por cambios de temperatura o composicin de la fase
mvil.
Ser capaz de monitorizar trazas de las especies a analizar.
No contribuir de forma apreciable al ensanchamiento de los picos.
Proporcionar una respuesta rpida que le permita detectar picos
cromatogrficos estrechos provenientes de la columna.
Ser robusto y fcil de mantener.
Sensibilidad
La seal ms baja detectable no debe ser nunca menor de tres veces la
altura del ruido promedio en la lnea de base; Es decir, una relacin seal a
ruido (S/N) de 3:1 para un analito determinado determina su "Limite de
Deteccion".
- 104 -
Selectividad
Sensibilidad
(Min. Masa Detectada)
Indice de Refraccin
Baja
15g
Conductividad
Baja
1050ng
Baja
0.11.0ng
Media
0.51.0ng
Electroqumico
Alta
50500pg
Fluorescencia
Alta
10100pg
Espectrmetro de Masas
Alta
125pg
UV/Visible
- 105 -
Rango Lineal
El Detector ideal debera proporcionar una seal de respuesta cuya rea
fuera proporcional a la cantidad de muestra inyectada, independientemente
de si est cantidad es grande o pequea. Esta linealidad no es infinita, pero
debe extenderse en el rango ms amplio posible. La pendiente de la recta
en el diagrama de abajo se denomina respuesta y representa en que
magnitud el detector responde a un cambio especfico en la concentracin
de la muestra:
- 106 -
Beam Splitter
- 107 -
- 108 -
- 109 -
- 110 -
La Celda de Flujo
La contaminacin de la propia celda o de sus ventanas puede ser el
resultado de una limpieza inadecuada del sistema o del tipo de muestra en
s misma. Unas ventanas de la celda que estn sucias producirn una
prdida progresiva tanto en la intensidad de la luz incidente como en la
saliente, afectando as a la absorbancia de los analitos y a su respuesta en
funcin del tiempo.
- 111 -
- 112 -
- 113 -
- 114 -
2.
- 115 -
- 116 -
- 117 -
- 118 -
- 119 -
- 120 -
- 121 -
2.
3.
La Fase Mvil
La mayora de los solventes de grado HPLC contendrn impurezas que
no absorban en el UV, o estn presentes a niveles de concentracin por
debajo de los lmites de deteccin de la mayora de otros detectores
LC, pero pueden ser la mayor fuente de contaminacin de iones
observada en el espectro de masas.
Las botellas de vidrio de H2O grado HPLC son extraordinariamente
proclives a contener iones sodio y potasio que generan iones aducto de
una intensidad significativa.
Modificadores de la Fase Mvil.
Muchos de los modificadores tpicos de las fases mviles pueden
generar por s mismos iones fuertes, o introducir iones contaminantes
en la fase mvil.
Siempre que sea posible deben utilizarse reactivos de la mayor pureza
posible, y minimizar la concentracin empleada.
Tubos de Conexin.
Evite los tubos de plstico para minimizar la introduccin de iones
Ftalato. El in de Ftalato 609Da es a menudo el pico base de cualquier
espectro de masas, y puede ser introducido inadvertidamente desde los
tapones con septum.
Minimice la contribucin de los Ftalatos purgando la fuente con N2 gas
a temperaturas ms altas de las utilizadas por trmino medio para
eliminar la contaminacin.
Utilice tubo PEEK incoloro para reducir el ruido de fondo.
- 122 -
4.
5.
- 123 -
- 124 -
Tutorial 3
Pregunta 1
Evaluar los problemas mostrados en el siguiente cromatograma y sugerir las
posibles causas de stos y cmo pueden corregirse:
Observaciones:
- 125 -
Pregunta 2
Usando los conocimientos adquiridos durante el curso complete un programa de
mantenimiento para su sistema de HPLC empleando la tabla de abajo como gua.
Componente
Frecuencia de Mantenimiento.
Cada..
Procedimiento de
Mantenimiento
48 Horas
Semana
Mes
+ Mes
La Fase Mvil
Solvente
Tamponado
Filtros de
Solvente
La Bomba
Check
Valves
Pistones y
Sellos
Frita Vlvula
de Purga
Cebado
El Autoinyector
Sello del
Rotor
Aguja y
Asiento de
la Aguja
La columna
Guarda
Columna
Columna
El Detector
Lmpara
Celda Flujo
- 126 -
Lneas de Base
La apariencia o el perfil de la lnea de base pueden ayudar en la
identificacin de muchos de los problemas asociados con los
componentes del sistema.
Forma de los Picos
La forma del pico cromatogrfico proporciona una valiosa informacin
al caracterizar las prestaciones proporcionadas tanto por los
componentes del sistema como por la columna.
Tiempos de Retencin
Cualquier variacin observada en los tiempos de retencin de los
analitos es crtica en el diagnstico para eliminar problemas del
sistema LC.
- 127 -
La siguiente tabla enumera una serie de razones por las cuales la lnea de
bsica puede ser errtica, junto a la solucin apropiada sugerida.
- 128 -
Causa Potencial
Desgasificacin mezcla incorrecta de la Fase Mvil
Solucin
Asegurese de desgasificar convenientemente.
Asegrese que la Fase Mvil se ha preparado correctamente de acuerdo al
PNT, incluyendo la(s) necesaria(s) etapa(s) de filtracin.
Bomba HPLC
Sustituya y compruebe
Realice los tests de mantenimiento especfico indicados por el fabricante
para evaluar la integridad de los componentes individuales del cabezal de
la bomba.
Limpie o sustituya los que sean necesarios siguiendo el protocolo descrito
(ver pg. 46 ss), o las instrucciones del fabricante.
Sustituya y compruebe.
Automuestreador
Columna
Detector
- 129 -
- 130 -
- 131 -
Causa Potencial
Desgasificacin o mezcla inapropiada de la fase mvil
Solucin
Asegurese de desgasificar convenientemente.
Asegrese que la Fase Mvil se ha preparado correctamente de acuerdo al
PNT, incluyendo la(s) necesaria(s) etapa(s) de filtracin.
Bomba HPLC
Automuestreador
Detector
instale
proteccin
- 132 -
contra
las
La tabla siguiente enumera diferentes razones por las que la lnea de base
del cromatograma puede mostrar oscilaciones de larga frecuencia junto con
su solucin adecuada.
- 133 -
Causa Potencial
Solucin
Botellas de Disolvente
Bomba de HPLC
Columna
Detector
Crawford Scientific
- 134 -
- 135 -
La tabla siguiente indica diferentes razones por las que la lnea de base del
cromatograma puede mostrar deriva junto con su solucin adecuada.
- 136 -
Causa Potencial
Fuerte absorbacia mostrada por un(os) componete(s) de la fase mvil.
Contaminacin y/o Evaporacin de la Fase Mvil.
Solucin
Si se usa un Detector Diodo-Array (DAD) seleccione una longitud de onda
de referencia y un ancho de banda adecuados para eliminar el efecto de
absorbancia del (los) componente(s).
Registre los n de lote de los disolventes y aditivos para identificar fuentes
potenciales de contaminantes que absorban.
Prepare fase mvil fresca y compruebe de nuevo.
Compruebe los puntos de ebullicin de los componentes de la fase mvil.
Tape las botellas de disolvente para evitar prdidas por evaporacin.
Bomba HPLC
Automuestreador
Cebe las lneas y lave el sistema de HPLC hasta que se obtenga una lnea
de base estable.
Columna
Detector
- 137 -
- 138 -
Causa Potencial
Solucin
Botellas de Disolvente
Bomba HPLC
Automuestreador
Columna
Crawford
Scientific
Revalide el mtodo si hay una prdida deresolucin
o cambia
la
selectividad de la columna.
Compruebe que el mtodo est operando en el rango correcto de pH para
esa columna.
Compruebe que el mtodo funciona dentro de los lmites de
especificados para esa columna.
Pertubaciones
electrnicos.
elctricas
spikes
provenientes
de
los
circuitos
pH
Captura de Datos
- 139 -
2007
10.2
Formas de Pico
- 140 -
Crawford
Scientific
2007
Crawford
Scientific
2007
- 141 -
- 142 -
Crawford
Scientific
2007
Crawford
Scientific
2007
- 143 -
- 144 -
Masa de muestra en g
Factor de Capacidad
Dimetro interno de la Columna en cm
Crawford
Scientific
2007
Crawford
Scientific
2007
- 145 -
- 146 -
Trimetilclorosilosano (TMCS)
Hexametildisilazano (HMDS)
Crawford
Scientific
2007
Crawford
Scientific
2007
- 147 -
- 148 -
Crawford
Scientific
2007
Crawford
Scientific
2007
- 149 -
- 150 -
Crawford
Scientific
2007
Crawford
Scientific
2007
- 151 -
2.
- 152 -
Crawford
Scientific
2007
Crawford
Scientific
2007
- 153 -
- 154 -
2.
Crawford
Scientific
2007
Crawford
Scientific
2007
- 155 -
10.3
Tiempo de Retencin
- 156 -
2.
Crawford
Scientific
2007
Crawford
Scientific
2007
- 157 -
Mtodo
Cambio Variable
Cambio Prom. tR
Flujo
Todos
+1%
-1%
Temperatura
+10C
-(12%)
- 158 -
RP-HPLC*
+1% (v/v)
-(510%)
pH
RP-HPLC
+0.01 unit
(01%)
Solvente Fuerte
Fase Normal
+1%
-(12%)
Tampn:
SEC
+1%
0%
Solvente Orgnico
* Incluyendo Cromatografa de Pares de Iones RP-HPLC
Pka
Rango pH efectivo*
Fosfato
2.1
1.1 3.1
7.2
6.2 8.2
12.3
11.3 13.3
Acetato
4.8
3.8 5.8
Citrato
3.1
2.1 4.1
4.7
3.7 5.7
5.4
4.4 6.4
Crawford
Scientific
2007
Crawford
Scientific
2007
- 159 -
- 160 -
Crawford
Scientific
2007
Crawford
Scientific
2007
- 161 -
10.4
- 162 -
2.
3.
4.
Crawford
Scientific
2007
Crawford
Scientific
2007
- 163 -
- 164 -
Particulas en la muestra
Las partculas existentes en la muestra producen contaminacin en la
frita de entrada de la columna, generando un incremento de la presin
y anormalidades en la forma de los picos p.ej. colas, desdoblamientos,
etc. Revise visualmente la calidad de la muestra disuelta antes de
inyectarla para decidir si necesita o no ser filtrada. Si el aspecto es
turbio o hay visible material particulado, filtre a travs de un filtro de
0.5 o 0.22m.
Instale un filtro de lnea entre el inyector y la columna, y si se
sospecha de contaminacin proveniente de la muestre instale una
guarda columna para servir de filtro qumico y de partculas.
2.
3.
Crawford
Scientific
2007
Crawford
Scientific
2007
- 165 -
10.5
Sensibilidad
Una baja sensibilidad puede producirse por alguna de las razones siguientes:
1.
2.
3.
4.
- 166 -
10.6 Recuperacin
Una mala recuperacin de la muestra puede producirse por mltiples
razones, pero se debe tpicamente a la adsorcin irreversible de los
ananlitos en la fase estacionaria o en los componentes extra-columna.
Aumente la fuerza eluotrpica de la fase mvil para minimizar la adsorcin.
Para la separacin de analitos bsicos emplee slice desactivada, columnas
con en-capping, o aada una base competitiva como la trietilamina para
minimizar las interacciones retentivas secundarias. Considere usar una
columna de fase estacionaria pomrica si la adsorcin en demasiado fuerte.
Emplee componentes inertes en las conexiones y tubos.
Crawford
Scientific
2007
Crawford
Scientific
2007
- 167 -