DETERMINACIN DE

1-1-2015 AZUCARES REDUCTORES POR

ESPECTROFOTOMETRA
(MTODO DNS)
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(MTODO DNS)

I. INTRODUCCIN

Los azucares reductores son aquellos azucares que poseen su grupo carbonilo
(grupo funcional) intacto, y que a travs del mismo pueden reaccionar como
reductores con otras molculas.

Todos los monosacridos son azucares reductores, ya que al menos tienen un

OH hemiacetlico libre, por lo que dan positivo a la reaccin con reactivo de 1
Fehling, a la reaccin con reactivo de Tollens, a la Reaccin de Maillard y la
Reaccin de Benedict. Otras formas de decir que son reductores es decir que
presentan equilibrio con la forma abierta, presentan mutarotacin (cambio
espontaneo entre las dos formas cicladas (alfa) y (beta)), o decir que formas
osazonas.

Un azcar reductor agregado al reactivo de Smogyi, va a producir un precipitado

de cobre reducido, en la forma de hidrato cuproso y oxido cuproso, que va a tener
un color rojo o amarillo, en su medio bsico (pH 9). En estas condiciones se
oxidan en su medio cido (pH 1,2 - 2,0) el arsenato y molibdato del reactivo de
Nelson, dando origen a la formacin de molibdeno azul, coloracin que se
mantiene estable por 24-36 horas y que puede leerse mediante un
espectrofotmetro a 520nm para la determinacin de la concentracin (Nelson,
1944; Somogyi, 1952; Gonzales & Castellanos, 2003

Los azucares reductores poseen un grupo carbonilo formando un grupo

hemiacetal que le confiere la caracterstica de poder reaccionar con otros
compuestos. El mtodo de Miller o DNS (cido dinitrosalicilico) como reactivo tiene
la capacidad de oxidar los azucares reductores mostrando un comportamiento
diferencial hacia mono y disacridos, dando resultados colorimtricos que se
puede medir con una longitud de onda de 575 nm.

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II. OBJETIVOS

Establecer la longitud de anda de la mxima absorcin para las diferentes

soluciones coloreadas.
Conocer y aplicar los principios de la curva patrn aplicada a la
cuantificacin de azucares reductores con el reactivo 3,5-dinitrosalcilico (3,5
DNS)
Cuantificar los azucares reductores presentes en el alimento.
2

III. FUNDAMENTO TEORICO

Los azcares como la glucosa, fructosa y sacarosa se acumulan especialmente en

el jugo celular; los almidones son los carbohidratos de reserva y se encuentran en
forma de plastidios; la hemicelulosa y pectinas son los polisacridos que
conforman el material estructural y las gomas son productos de desecho.
Tradicionalmente las frutas se han valorado por su atractiva apariencia, textura,
valor nutritivo y fundamentalmente por su sabor.

En todos estos atributos de calidad los carbohidratos desempean un papel

relevante, por ejemplo, el sabor est dado bsicamente por un balance entre
azcares y cidos orgnicos. El sabor caracterstico de y diferente de las frutas se
debe a la gran variacin en composicin y concentracin de los azcares; el color
atractivo se debe principalmente a los glucsidos (antocianinas y antoxantinas) y
la firmeza est determinada por los polisacridos estructurales.

Es importante sealar que las proporciones de los diversos carbohidratos

existentes en las frutas pueden experimentar modificaciones como consecuencia
de la actividad metablica, ya que durante la maduracin se producen cambios
intensos en donde los azcares son los sustratos preferidos para la biosntesis y
suministro de energa pues son oxidados (va gluclisis) hasta cido pirvico, el

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cual a su vez, por descarboxilacin oxidativa se convierte en Acetil-CoA que se

metaboliza, va ciclo de Krebs, dando lugar a la formacin de CO 2, H2O y
ENERGA la cual queda disponible para la biosntesis de otros componentes
(otros azcares, cidos orgnicos, cido ascrbico, protenas, nucletidos
azucarados, glucsidos, etc.).

Durante todo este proceso, el contenido de azcares aumenta casi

invariablemente bsicamente por hidrlisis que experimentan los polisacridos,
3
aunque algunos azcares sean utilizados como sustratos para la actividad
respiratoria.

Dada la importancia de estos compuestos se han desarrollado varios mtodos

para su determinacin: Fehling, Benedict, Somogy, Lane-Enyon, Hagerdorn-
Hensen, etc., pero todos ellos se basan en el mismo principio:

Todos los azcares con un grupo aldehdo libre o un grupo cetnico se clasifican
como azcares reductores y se transforman fcilmente en enedioles (reductonas)
al calentarlos en soluciones alcalinas; dichos enedioles son altamente reactivos y
se oxidan fcilmente en presencia de oxgeno u otros agentes oxidantes, por lo
tanto, los azcares en solucin alcalina rpidamente reducen iones oxidantes
como Ag+, Hg+, Cu2+ y Fe(CN)63- y los azcares se oxidan formando mezclas
complejas de cidos. Esta accin reductora es la que se utiliza tanto en las
determinaciones cualitativas como cuantitativas.

Una de las tcnicas analticas ms potentes consiste en determinar la cantidad de

una substancia disuelta midiendo la cantidad de radiacin absorbida por la misma.
Esta tcnica se llama Espectrofotometra.

Se puede utilizar el espectrofotmetro para determinar la longitud de onda de la

radiacin necesaria para las determinaciones de la cantidad de azcar en las
muestras bajo estudio, comparndola despus con la radiacin absorbida por un
blanco.

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La regla especfica que relaciona la cantidad de radiacin absorbida por una

substancia con la concentracin de esa misma substancia se llama Ley de Beer y
se puede establecer como sigue:

Log Io = abc
I

En donde:
4
Io = Radiacin incidente o radiacin transmitida por el blanco.

I = Radiacin transmitida por la muestra.

Log Io = absorbancia de la muestra

En donde:

a = coeficiente de absorbancia (absortividad) las unidades dependen de las

unidades utilizadas para la determinacin de la concentracin.

b = longitud de la celda usualmente en centmetros.

c = concentracin de la muestra en las unidades apropiadas.

Los carbohidratos tambin llamados azcares, osas o sacridos, son

polihidroxialdehidos o polihidroxicetonas o compuestos polimricos que por
hidrlisis producen polihidroxialdehidos y polihidroxicetonas.

Segn el nmero de unidades de azcares sencillos que posean se clasifican en:

MONOSACRIDOS o azcares sencillos, que a su vez pueden ser

ALDOSAS cuando contienen el grupo aldehdo o CETOSAS cuando
contienen el grupo cetona. Los monosacridos naturales pertenecen a la
serie D de los azcares y pueden tener entre tres y hasta siete tomos de
carbono.

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DISACRIDOS que estn formados por dos monosacridos unidos entre s

por enlaces glucosdicos.

OLIGOSACRIDOS que tienen entre tres y diez monosacridos unidos

tambin por enlaces glucosdicos.

POLISACRIDOS que son polmeros naturales con varios miles de

unidades de azcar sencillo ligadas entre s.
5

De acuerdo con lo anterior, adems de reconocer si un compuesto pertenece a la

familia de los carbohidratos, es necesario diferenciar si se trata de un
monosacrido tipo aldosa o cetosa, si es fcilmente oxidable o no, es decir si es
un AZCAR REDUCTOR o no lo es, si es de cinco tomos de carbono (pentosa)
o de seis tomos de carbono (hexosa), si es disacrido o polisacrido.

ENSAYO DE MOLISCH: Este ensayo es un ensayo para reconocimiento

general de carbohidratos en el que los polisacridos y disacridos se
hidrolizan con cido sulfrico concentrado hasta monosacridos y se
convierten en derivados del furfural o 5-hidroximetil furfural los cuales
reaccionan con -naftol formando un color prpura violeta.

ENSAYO DE BENEDICT: El ensayo de Benedict permite el reconocimiento

de carbohidratos reductores, al igual que el reactivo de Felhing, el de
Benedict contiene ion cprico en medio alcalino que se reduce hasta xido
cuproso en presencia de azcares con el hidroxilo hemiacetlico libre.

ENSAYO DE BARFOED: Esta prueba permite diferenciar entre

monosacridos y disacridos reductores, tambin contiene ion cprico que
se reduce hasta xido cuproso ms rpidamente con los monosacridos
que con los disacridos.

ENSAYO CON LUGOL: El reactivo de Lugol que contiene una mezcla de

yodo y yoduro, permite reconocer polisacridos, particularmente el almidn
por la formacin de una coloracin azul- violeta intensa y el glicgeno y las
dextrinas por formacin de coloracin roja.

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ENSAYO DE SELIWANOFF: Este ensayo es especfico para cetosas y se

basa en la conversin de la cetosa en 5-hidro-metil-furfural y su posterior
condensacin con resorcinol formando as complejos coloreados.

ENSAYO DE BIAL: El reactivo de Bial contiene orcinol en cido clorhdrico,

el cual forma complejos de coloracin slo con las pentosas.

De otro lado una propiedad importante que permite identificar los carbohidratos, y
determinar el grado de pureza de los mismos, particularmente monosacridos es 6
la rotacin ptica ocasionada por la presencia de centros asimtricos o quirales en
la estructura molecular, los cuales desvan el plano de luz polarizada.

Esta propiedad no es exclusiva de los carbohidratos pues la presentan todas

aquellas sustancias denominadas ptimamente activas, por tener en su estructura
centros quirales.

Para la medicin de la rotacin ptica los factores importantes a tener en cuenta

son: La longitud de onda de luz polarizada, la cantidad de material ptimamente
activo, y la naturaleza del solvente cuando se usa. Los cambios en la temperatura
ocasionan solo pequeas variaciones en las medidas de la rotacin.

La espectrofotometra es uno de los mtodos de anlisis ms usados, y se basa

en la relacin que existe entre la absorcin de luz por parte de un compuesto y su
concentracin.

Cuando se hace incidir luz monocromtica (de una sola longitud de onda) sobre un
medio homogneo, una parte de la luz incidente es absorbida por el medio y otra
transmitida, como consecuencia de la intensidad del rayo de luz sea atenuada

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desde Po a P, siendo Po la intensidad de la luz incidente y P la intensidad del rayo

de luz transmitido.

Dependiendo del compuesto y el tipo de absorcin a medir, la muestra puede

estar en fase lquida, slida o gaseosa. En las regiones visibles y ultravioleta del
espectro electromagntico, la muestra es generalmente disuelta para formar una
solucin.

Cada sustancia tiene su propio espectro de absorcin, el cual es una curva que
muestra la cantidad de energa radiante absorbida, Absorbancia, por la sustancia
en cada longitud de onda del espectro electromagntico, es decir, a una 7
determinada longitud de onda de la energa radiante, cada sustancia absorbe una
cantidad de radiacin que es distinta a la que absorbe otro compuesto (Fig. 1).

IV. EXPERIMENTACION

4.1. MATERIALES.

A) Materiales:
Materiales de vidrio: Fiolas, pipetas, vasos de precipitados

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B) Reactivos DNS

Tartrato de Sodio y Potasio

Hidrxido de Sodio
Metabisulfito de Sodio
Reactivo DNS

C) Equipos

Espectrofotmetro UV-Vis-NIR JASCO, MODELO v-670

Centrifuga digital Sigma
Agitador para tubos de ensayos.

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4.2. METODOLOGA.

PREPARACIN DEL REACTIVO DNS

Se prepara segn el mtodo propuesto por Coughlan y Moloney. Se

aade 10 g de cido dinitrosaliclico (DNS) y 300 g de tartrato de sodio y
potasio (sal de Rochelle) a 800 ml de NaOH 0,5 N y se calienta 9
suavemente para disolver los reactivos. El volumen se completa hasta
1,0 L con agua destilada (MP Coughlan, AP Moloney, 1988).

PREPARACIN DE LA CURVA PATRN

Se implementa el mismo mtodo para realizar la curva patrn, como se

describi en el mtodo fenol-sulfrico. Empleando una solucin patrn
de glucosa con una concentracin de 1.0 g/L, para la cual se disuelve
0.1 gramos de glucosa en 90 ml de agua y se lleva a volumen a 100 ml.
Esta solucin patrn se prepara a diferentes concentraciones
adicionando a cada tubo 1 ml del reactivo DNS con agitacin constante.
Posteriormente se lleva a bao mara durante 15 minutos se deja enfriar
y se aade agua destilada hasta completar el volumen respectivo. Se
determina la absorbancia de cada tubo a 575 nm en el
espectrofotmetro UV.

PREPARACIN DE LA MUESTRA

Se toma 1 ml de la solucin acuosa de la muestra, enseguida se

adiciona 1ml del reactivo de DNS y se calienta por 15 minutos en bao
mara. Se deja enfriar y se diluyen con 10 ml de agua destilada. Se
procede a leer la absorbancia junto con el blanco a la misma longitud de
onda que las muestras para la curva patrn.

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V. PROCEDIMIENTO

PREPARACIN DE LA SOLUCIN MADRE.

0.2gr de Glucosa
(99.9%)
10

2gr/l Solucin madre

500ul 400ul 300ul 200ul 100ul 50ul 500ul

mad madre + madre + madre + madre + madre + H2O
100ul h2O 200ul h2O 300ul h2O 400ul h2O 450ul h2O

500ul de DNS

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T= 100 C
TODOS LAS
DURANTE: 5min
SOLUCIONES

11

T= 4 C
DURANTE: 3min

Solucin Solucin Solucin Solucin Solucin Solucin Solucin

+ 5ml de + 5ml de + 5ml de + 5ml de + 5ml de + 5ml de + 5ml de
H2O H2O H2O H2O H2O H2O H2O

LLEVAR LA SOLUCIN
HACER ANALIZADA EN EL
ESPECTOFOTOMETRO

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PESO (Jugo): 70,87 PESO (Jugo): 52.5259

12

Extraccin del jugo

4 tubos - Naranja

3 tubos - Mandarina
t= 20 min

Solucin Solucin Solucin Solucin

50 20 + 50 + 20 +
+ 450ml 480ml 450ml 480ml de
de H2O de H2O de H2O H2O

Adicionar DNS
500 c/u

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13

EN CALOR :
En un tiempo de 5 min

EN FRIO :
En un tiempo de 3 min

Agregar 5ml de agua

destilada a c/u

HOMOGENIZAR

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GRUPO C
VI. RESULTADOS

Volumen Volumen H2O g/L Absorbancia

Solucin (l)
Madre (l)
1 500 - 2 0.6467
2 400 100 1.6 0.5247 14
3 300 200 1.2 0.4316
4 200 300 0.8 0.2326
5 100 400 0.4 0.1216
6 50 450 0.2 0.0714
7 - 500 0 0

Abs Vs C
0.69 2 1.6 1.2 0.8 0.4 0.2 0
0.66 0.6467
0.63
0.6
0.57
0.54 0.5271
0.51
0.48
0.45
0.42 0.4316
0.39
0.36
0.33
0.3
0.27
0.24 0.2326
0.21
0.18
0.15
0.12 0.1216
0.09
0.06 0.0714
0.03
0 0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 2.2

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GRUPO A

Volumen Solucin Volumen H2O g/L Absorbancia

Madre (l) (l)
1 500 - 2 0.6895 15
2 400 100 1.6 0.5343
3 300 200 1.2 0.4411
4 200 300 0.8 0.2713
5 100 400 0.4 0.0964
6 50 450 0.2 0.0551
7 - 500 0 0

0.8

0.7 y = 0.1204x - 0.063

R = 0.9695
0.6

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

0
0 1 2 3 4 5 6 7
-0.1

-0.2

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GRUPO B

Volumen Solucin Volumen H2O g/L Absorbancia

Madre (l) (l) 16
1 500 - 2 0.7239
2 400 100 1.6 0.5729
3 300 200 1.2 0.4350
4 200 300 0.8 0.2835
5 100 400 0.4 0.1344
6 50 450 0.2 0.0737
7 - 500 0 0

0.8
y = 0.124x - 0.0542
0.7 R = 0.9797

0.6

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

0
0 1 2 3 4 5 6 7
-0.1

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GRUPO D

Volumen Solucin Volumen H2O g/L Absorbancia

Madre (l) 17
(l)
1 500 - 2 0.7244
2 400 100 1.6 0.5735
3 300 200 1.2 0.4328
4 200 300 0.8 0.2826
5 100 400 0.4 0.1368
6 50 450 0.2 0.0551
7 - 500 0 0

0.8
y = 0.1255x - 0.062
0.7 R = 0.9801
0.6

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

0
0 1 2 3 4 5 6 7
-0.1

-0.2

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RESULTADOS
Naranja Mandarina

Volumen Volumen g/L Absorbancia

Solucin H2O (L)
Madre (L)

50 L 450 L 20 0.9601
NARANJA 18

20 L 480 L 50 0.2785

50 L 450 L 20 0.8041
MANDARINA

20 L 480 L 50 0.3211

Naranja
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
20 50
Absorbancia

Mandarina
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
20 Absorbancia50

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VII. DISCUSIONES

Los azucares reductores tambin pueden variar en su porcentaje segn el

tipo de fruta por lo que la cantidad de azucares reductores va a estar
influenciada por las condiciones de la fruta, (Silveira et al, 2007).

Todos los azcares con un grupo aldehdo libre o un grupo cetnico se 19

clasifican como azcares reductores y se transforman fcilmente en
enedioles (reductonas) al calentarlos en soluciones alcalinas; dichos
enedioles son altamente reactivos y se oxidan fcilmente en presencia de
oxgeno u otros agentes oxidantes, por lo tanto, los azcares en solucin
alcalina rpidamente reducen iones oxidantes como Ag+ Hg+Cu2+ y Fe
(CN) 63- y los azcares se oxidan formando mezclas complejas de cidos.
Esta accin reductora es la que se utiliza tanto en las determinaciones
cualitativas como cuantitativas.

Es importante sealar que las proporciones de los diversos carbohidratos

existentes en las frutas pueden experimentar modificaciones como
consecuencia de la actividad metablica, ya que durante la maduracin se
producen cambios intensos en donde los azcares son los sustratos
preferidos para la biosntesis y suministro de energa pues son oxidados
(va gluclisis) hasta cido pirvico, el cual a su vez, por descarboxilacin
oxidativa se convierte en Acetil-CoA que se metaboliza, va ciclo de Krebs,
dando lugar a la formacin de CO2 H2O y ENERGA la cual queda
disponible para la biosntesis de otros componentes (otros azcares, cidos
orgnicos, cido ascrbico, protenas, nucletidos azucarados, glucsidos,
etc.)

El sabor caracterstico de y diferente de las frutas se debe a la gran

variacin en composicin y concentracin de los azcares; el color atractivo
se debe principalmente a los glucsidos (antocianinas y antoxantinas) y la
firmeza est determinada por los polisacridos estructurales.

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VIII. CONCLUSIONES

Con esta prctica pudimos determinar de manera cuantitativa la

concentracin de azucares en determinadas muestras con concentraciones
conocidas para poder obtener la curva patrn de la absorbancia en la
muestra y muestras de concentraciones y/o disoluciones como se observa
20
en la grfica de los resultados, con la curva obtenida se realiza una grfica
de tendencia lineal que se ajusta a los datos.

El mtodo DNS es un tcnica colorimtrica que emplea 3.5-cido

dinitrosaliclico para la hidrlisis de polisacridos presentes en una muestra,
seguido de la determinacin espectrofotomtrica a 540nm de los azucares
reductores

Comprobamos que la espectrofotometra es el mtodo de anlisis ptico

ms adecuado para la determinacin de una concentracin en una muestra.
Dicho de otro modo es un instrumento que permite comparar la radiacin
absorbida o transmitida por una solucin que contiene una cantidad
desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la
misma sustancia en este cado la glucosa.

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