Protocolo para El Aislamiento y Purificación de Catalasa A Partir de Tejido Hepático de Pollo
Protocolo para El Aislamiento y Purificación de Catalasa A Partir de Tejido Hepático de Pollo
Protocolo para El Aislamiento y Purificación de Catalasa A Partir de Tejido Hepático de Pollo
✓ Albúmina de suero bovino FUNDAMENTO (2): El ensayo de Bradford se basa en la unión del
colorante Azul de Coomassie G-250 a la proteína, específicamente, la
✓ Espectrofotómetro UV-vis forma azul más aniónica del colorante, que tiene un máximo de
absorbancia a 595 nm. Por tanto, al medir la absorbancia de la
✓ Sulfato de Amonio
solución a esa longitud de onda, podemos estimar la cantidad de
proteína.
AISLAMIENTO Y CONCENTRACIÓN
Se utilizará el homogeneizado anterior y se someterá a una precitación ordenada con sulfato de amonio
(10, 20, 30, 40, 50, 60 y 70%). Se determinará la actividad enzimática para cada precipitación. Según Min
Jung et al. (3), se observarán precipitados del 40 al 80% de sulfato de amonio, estos se disolverán en un
volumen mínimo de tampón fosfato 10 mM (pH 7,5) y se someterán a diálisis durante 2 h con 2 cambios
de tampón.
La muestra dializada y filtrada, según Min Jung et al. (3), cargará en una columna de DEAE-Sephadex A-
50 y se lavará con tampón fosfato 10 mM (pH 7,5), hasta que la absorbancia del eluato obtenido a 280 nm
sea <0.05. Las proteínas unidas se someterán a elución con un gradiente de cloruro sódico de 0 a 400 mM
en tampón fosfato 10 mM (pH 7,5) a un caudal de 20 ml / h. Los eluidos se recogerán en tubos de 2 mL y
cada a una se le determinará su actividad y absorbancia por separado a 240 y 280 nm. Todo este
procedimiento se realizará manteniendo una temperatura de 4 °C.
FUNDAMENTO (4): El principio básico de la cromatografía de intercambio iónico es que las moléculas
cargadas se adhieren a los intercambiadores de forma reversible de modo que dichas moléculas pueden
ser asociadas o disociadas cambiando el ambiente iónico. La separación mediante intercambiadores
iónicos se realiza por lo general, en dos fases: en la primera las sustancias a separar se unen al
intercambiador utilizando condiciones que originan una unión fuerte y estable; a continuación, se eluye
de la columna con buffers de diferentes pH o diferente fuerza iónica, compitiendo los componentes del
buffer con el material por los sitios de unión.