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    Protocolo para El Aislamiento y Purificación de Catalasa A Partir de Tejido Hepático de Pollo

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    Maximo Rosales
    Protocolo para el aislamiento y purificación de catalasa a partir de tejido hepático de pollo, según los alumnos de la mesa 1, Bioquímica I.

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    Protocolo para El Aislamiento y Purificación de Catalasa A Partir de Tejido Hepático de Pollo

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    Protocolo para el aislamiento y purificación de catalasa a partir de tejido hepático de pollo, según los alumnos de la mesa 1, Bioquímica I.

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    Protocolo para el aislamiento y purificación de catalasa a partir de tejido hepático de pollo

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    UNMSM

    EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE CATALASA DE HÍGADO DE POLLO


    PROTOCOLO

    Cáceres Antaurco, Danny; Miranda Loredo, Daniella; Rosales Trinidad,


    Máximo; Soto Tantaraico, Edith.

    OBJETIVOS ELECCIÓN DE LA FUENTE


    ✓ Cuantificar la actividad La catalasa es una enzima antioxidante, que se encuentra presente en
    específica de la catalasa células eucariotas y algunas bacterias. Están en mayor proporción en
    “fuente” en el extracto los órganos como hígados y riñones, por ello en el presente estudio
    crudo se evaluará la actividad enzimática de la enzima catalasa proveniente
    del hígado de pollo (1)
    ✓ Determinar el % de
    recuperación y el grado
    de purificación de la EXTRACCIÓN DE LA PROTEÍNA DE LA FUENTE
    catalasa mediante “la
    técnica que Se preparará el homogeneizado con 20 g de hígado de pollo fresco el
    emplearemos” cual se corta con un cuchillo. Se eliminará de las muestras el exceso
    de sangre, tejidos extraños y membranas. El tejido se suspenderá con
    5 volúmenes (p / v) de tampón fosfato 10 mM (pH: 7,5) que debe
    MATERIALES contener CaCl2 5 mM y se mezclará usando un batidor a velocidad
    máxima durante 3 min. El material se homogeneizará mediante un
    ✓ 20 g de hígado de pollo
    homogeneizador ultrasónico durante 2 min. Después de eso, se
    fresco
    procederá a centrifugar a 7.000 xg durante 20 min y el sobrenadante
    ✓ 5 volúmenes (p / v) de se utilizará para la precipitación con sulfato de amonio. La
    tampón fosfato 10 mM (pH: temperatura se mantendrá a 4 ºC.
    7,5) + CaCl2 5 mM

    ✓ Homogeneizador CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNA EN EXTRACTO CRUDO


    ultrasónico
    La determinación cuantitativa de proteínas se midió
    ✓ Batidor
    espectrofotométricamente a 595 nm según el método de Bradford,
    ✓ Azul de Coomassie G-250 utilizándose albúmina de suero bovino como patrón.

    ✓ Albúmina de suero bovino FUNDAMENTO (2): El ensayo de Bradford se basa en la unión del
    colorante Azul de Coomassie G-250 a la proteína, específicamente, la
    ✓ Espectrofotómetro UV-vis forma azul más aniónica del colorante, que tiene un máximo de
    absorbancia a 595 nm. Por tanto, al medir la absorbancia de la
    ✓ Sulfato de Amonio
    solución a esa longitud de onda, podemos estimar la cantidad de
    proteína.
    AISLAMIENTO Y CONCENTRACIÓN

    PRECIPITACIÓN CON SULFATO DE AMONIO Y DIÁLISIS

    Se utilizará el homogeneizado anterior y se someterá a una precitación ordenada con sulfato de amonio
    (10, 20, 30, 40, 50, 60 y 70%). Se determinará la actividad enzimática para cada precipitación. Según Min
    Jung et al. (3), se observarán precipitados del 40 al 80% de sulfato de amonio, estos se disolverán en un
    volumen mínimo de tampón fosfato 10 mM (pH 7,5) y se someterán a diálisis durante 2 h con 2 cambios
    de tampón.

    FUNDAMENTO (4): La precipitación fraccionada con sulfato de amonio se fundamenta en la alta


    solubilidad de la sal y en la solubilidad de las proteínas que varía de acuerdo con la concentración de
    sal. A bajas concentraciones de iones (<0.5 M), la solubilidad de las proteínas aumenta al aumentar la
    concentración de sal; sin embargo, medida que se sigue aumentando la concentración de sal, la
    solubilidad de la proteína comienza a disminuir, estado de sobresaturación. Por su parte, la diálisis es el
    proceso de separar las moléculas en una solución por la diferencia en sus índices de difusión o presión
    osmótica a través de una membrana semipermeable.

    PURIFICACIÓN POR CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO

    La muestra dializada y filtrada, según Min Jung et al. (3), cargará en una columna de DEAE-Sephadex A-
    50 y se lavará con tampón fosfato 10 mM (pH 7,5), hasta que la absorbancia del eluato obtenido a 280 nm
    sea <0.05. Las proteínas unidas se someterán a elución con un gradiente de cloruro sódico de 0 a 400 mM
    en tampón fosfato 10 mM (pH 7,5) a un caudal de 20 ml / h. Los eluidos se recogerán en tubos de 2 mL y
    cada a una se le determinará su actividad y absorbancia por separado a 240 y 280 nm. Todo este
    procedimiento se realizará manteniendo una temperatura de 4 °C.

    FUNDAMENTO (4): El principio básico de la cromatografía de intercambio iónico es que las moléculas
    cargadas se adhieren a los intercambiadores de forma reversible de modo que dichas moléculas pueden
    ser asociadas o disociadas cambiando el ambiente iónico. La separación mediante intercambiadores
    iónicos se realiza por lo general, en dos fases: en la primera las sustancias a separar se unen al
    intercambiador utilizando condiciones que originan una unión fuerte y estable; a continuación, se eluye
    de la columna con buffers de diferentes pH o diferente fuerza iónica, compitiendo los componentes del
    buffer con el material por los sitios de unión.

    EVALUACIÓN DEL PROCESO DE PURIFICACIÓN


    REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

    1. Coban A, Ciftci M, Ozdemir H, Altika S. Purification and characterization of catalase enzymes


    from chicken liver and sheep erythrocytes. Asian J Chem. 2007;19(5):3941–53.
    2. Kruger NJ. The Bradford Method For Protein Quantitation. En Humana Press, Totowa, NJ; 2009
    [citado 9 de septiembre de 2020]. p. 17-24. Disponible en:
    https://link.springer.com/protocol/10.1007/978-1-59745-198-7_4
    3. Jang MJ, Park PJ, Jung WK, Kim SEK. Purification and characterization of a catalase from the liver
    of bullfrog, Rana catesbeiana shaw. J Food Biochem. 2004;28(6):435–48.
    4. Voet D, Voet J, Pratt C. Fundamentals of Biochemistry life at the molecular level. 2011.

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