Informe-Bioquimica-Biologia-2023-24 Sergi Mollá Caballero 1a A4
Informe-Bioquimica-Biologia-2023-24 Sergi Mollá Caballero 1a A4
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1º Grado de Biología
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular. Universidad Complutense de Madrid
PRÁCTICAS DE
BIOQUÍMICA
1º Grado en Biología
Curso 2023-2024
Práctica II
1
Prácticas de Bioquímica. 1º Grado de Biología
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular. Universidad Complutense de Madrid
6ml 5,5ml
Tampón
pH 3,06 pH 10,22
0,1 ml 0,1 ml
H2O
pH 3,07 pH 10,4
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¿Por qué se han empleado las especies monopotásica y dipotásica para realizar el tampón?
Utilizamos estas especies debido a que su equilibrio tiene el valor de pka (7,21) más cercano al equilibrio
(7), que nos será más beneficioso para mantener la capacidad tamponadora de la disolución.
¿Por qué se ajusta el pH tras disolver la cantidad calculada de las especies del tampón?
Porque es una forma de garantizar que todo está correcto, ya que siempre nos podemos equivocar en los
cálculos o incluso el material a utilizar como la báscula pueden estar dañados.
Si hubiéramos utilizado un tampón con menor concentración, a la hora de añadir un ácido o una base el
PH variaría con mayor facilidad puesto que a menor concentración menor es la capacidad de
tamponamiento.
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Práctica III
2. Con el resultado de la concentración de DNA obtenido en la práctica VIII (ojo con la dilución),
calcular el rendimiento del proceso de extracción de DNA como µg de DNA obtenido por g de
cebolla.
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¿Para qué se usa EDTA en los tampones de homogeneización y de resuspensión del DNA?
Se utiliza EDTA en los tampones de homogeneización y resuspensión del ADN para proteger el ADN de la
degradación enzimática al quelatar iones metálicos y mantener el pH adecuado de la solución.
Los iones de Na+ del NaCI forman enlaces con los grupos fosfato de las moléculas de ADN, neutralizando
las cargas eléctricas del ADN y evita las uniones del DNA a proteínas. De esta manera se facilita la
precipitación del ADN de la solución al añadir el alcohol.
El ADN no se disuelve en alcohol. Por tanto el añadir alcohol hace que el ADN se agregue y se precipite de
la solución.
Se ve el DNA blanquecino debido a que cuando este precipita, las moléculas se agrupan formando una
estructura solida y cristalina que dispersa la luz, lo que resulta en la apariencia blanquecina del
precipitado cuando se observa a simple vista.
Cuando lavamos el DNA en etanol 70% lo que conseguimos es eliminar las impurezas, como las sales.
¿El DNA obtenido está puro? ¿Cómo se podría mejorar la pureza de la preparación?
No, el DNA no es puro. Podríamos mejorar la pureza con una cromatografía de penetrabilidad.
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2. ¿Qué volumen de esa disolución necesitarías para aplicar 1 µg de DNA en una electroforesis?
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Práctica IV
% SATURACIÓN 20,25%
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Podemos observar una primera muestra que presenta las siguientes características: poco precipitado y un
sobrenadante con un color un más claro que la muestra original; y una segunda muestra con las
siguientes características: un mayor precipitado con un color más oscuro que el anterior y un
sobrenadante notoriamente más claro. Deducimos que con cada precipitación el precipitado tiene mayor
concentración de Hb, por eso el color, y que la concentración en el sobrenadante se reduce.
¿La recuperación cuantificada se corresponde con el resultado visual? ¿Es el resultado esperado?
Es lo que se esperaba, el primer sobrenadante con mayor concentración presenta un color más oscuro,
mientrs que el segundo es más claro y por tanto menos concentrado.
¿En qué se diferencia la disolución inicial de hemoglobina de la final tras la precipitación salina?
La principal diferencia la encontramos en que la disolución inicial era de un color más oscuro y además se
encontraba en una sola fase, mientras que tras la precipitación encontramos una disolución en dos fases
(precipitado y sobrenadante) y de color más clara.
Se parte de una mezcla de tres proteínas: P1, P2 y P3. Sabiendo que precipitan en los
siguientes porcentajes de saturación de sulfato amónico respectivamente: 15, 40 y 65%; ¿cómo
diseñarías un protocolo para separar las tres proteínas partiendo de un volumen inicial de 15 ml?
Incluye los cálculos necesarios.
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IV-B. DIÁLISIS
1. Cálculos para preparar 2 litros de tampón fosfato 20 mM pH 7.0 a partir de la disolución madre.
Incoloro
COLOR Incoloro
Medio de (amarillento)
diálisis Ferricianuro
COMPUESTOS Agua destilada
potásico
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En la primera diálisis se consigue separar gracias a los diferentes pesos moleculares, los diferentes
colorantes de la mezcla. El ferrocianuro potásico al tener un p.m más bajo, sus moléculas consiguen
atravesar la membrana y pasan al medio de la diálisis. Mientras que el azul de dextrano ,que tiene mayor
p.m, no consigue atravesar la membrana y se queda en el interior.
Con esta diálisis conseguimos separar la hemoglobina de las impurezas , como por ejemplo las sales, que
se hayan podido quedar en la muestra. Estas impurezas atravesarán la membrana semipermeable de la
diálisis gracias a su bajo peso molecular, aislando la hemoglobina.
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Práctica V
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Conc.
Conc. DILUCIÓN DILUCIÓN de la
TUBO Nº PROTEINA
(µg/ml) muestra en los 300 µl
original (µg/ml)
11- Dil. problema A 345,81
2
12- Dil. problema A 340,63
1972,27
13- Dil. problema B 319,88
10
14- Dil. problema B 331,74
15- Hb S1 73,6
15 5365,05
16- Hb S1 260,26
17- Hb S2 111,74
6
18- Hb S2 119,89
576,71
19- Hb S2b 153,96
3
20- Hb S2b 151,74
21- Hb P2 280,26
15 4087,2
22- Hb P2 263,96
23- Hb D 262,26 15 3995,55
24- Hb D 270,26
Encontramos estos datos dentro de la curva de calibrado, donde los datos son fiables. Encontramos dos
caso donde son directamente proporcionales.
Aunque en nuestro caso las absorbancias y datos como el % de recuperación sean mayores a la media,
pienso que si podemos fiarnos de los datos. Hay que tener en cuenta algunos ejemplos como los tubos 14
y 14, cuyos valores son “exagerados” y no podemos utilizarlos como validos. Estos posiblemente se hayan
dado por un mal pipeteo o por contaminación de la muestra.
Podriamos mejorar el ajuste de la curva de calibrado si se añadieran más valores. Cuantos más valores,
menor será el error.
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¿Qué otros métodos, directos o indirectos, podrías usar con la misma finalidad?
7.Podríamos
TAREAS utilizar
COMPLEMENTARIAS (1/2
métodos como el de página
Biuret máximo)
y Lowry o incluso una electroforesis.
En la práctica de la electroforesis se van a preparar:
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Práctica VI
1. Adjuntar la imagen del gel con la leyenda de lo aplicado en cada carril y los tamaños de las
moléculas del patrón (en Kb o pb).
1- Control
2- DNA Salmón
3- DNA Plasmídico
12- Vacío
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Teniendo en cuenta la apariencia en la imagen y comparándolo con el control, ¿qué se puede decir
del DNA purificado?
Por lo que se refiere al DNA de cebolla, la electroforesis ha salido correctamente. Podemos apreciar como
la muestra de DNA de cebolla con DNAasas ha sido capaz de desplazarse más que la muestra sin
DNAasas. Esto se debe a que las DNAasas son enzimas pueden cortar el ADN en fragmentos más
pequeños durante el proceso de electroforesis. Como resultado, los fragmentos de ADN más pequeños
tendrán una movilidad eléctrica mayor en el gel y se desplazarán más lejos en un tiempo determinado en
comparación con los fragmentos más grandes.
¿Esperarías uno o varios tamaños para una muestra de DNA genómico eucariota? ¿Puedes calcular
el tamaño total del DNA genómico con esta técnica?
Esperarías ver múltiples tamaños de fragmentos de DNA ya que el genoma eucariota está compuesto por
una variedad de secuencias de ADN de diferentes longitudes.
En un gel de electroforesis, el ADN genómico eucariota suele aparecer como una banda continua y difusa
debido a la presencia de múltiples fragmentos de diferentes longitudes. Por lo tanto, no es posible
calcular el tamaño total del ADN genómico con precisión utilizando solo esta técnica de electroforesis.
¿Qué puedes decir de la muestra de DNA plasmídico? ¿Está pura, puedes calcular su tamaño?
En el caso del DNA plasmídico podemos observar patrones de elevadas masas moleculares a lo largo de la
columna. EN concreto observamos 3 bandas cuyo origen puede que sea el estado de el DNA:
superenrollado, lineal y relajado.
El DNA plasmídico se puede considerar puro, puesto que no se ha corrido a lo largo de la columna, lo cual
nos indica que no hay presencia de DNAasas.
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Práctica VII
1. Adjuntar la imagen del gel con la leyenda de lo aplicado en cada carril y las masas moleculares del
patrón.
2- Sobrenadante 1
3- Sobrenadante 2
4- Precipitado 2
5- Hb-D
6- Extracto de cebolla
8- DNA
9- Muestra de prot 1
- Calcular la movilidad relativa (µr) de las distintas bandas que aparecen en el gel, proteínas
problema y patrones. µr= distancia recorrida por la proteína problema/distancia del frente
(azul de bromofenol). Las distancias se miden desde el comienzo del gel separador.
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¿Qué contienen las muestras problema M1 y M2? ¿Puedes identificar las proteínas en función de su
masa molecular?
No es posible conocer los componentes de las muestras 1 y 2, ya que para eso necesitaríamos conocer la
composición del patrón para utilizarlo de guía y no lo conocemos.
¿Qué diferencias hay entre las muestras de la precipitación y diálisis de la hemoglobina? ¿Coincide
el resultado con las concentraciones calculadas en las prácticas V y VIII?
La diferencia que encontramos entre estas muestras es la pureza. Como podemos observar la muestra de
Hb-D presenta bandas finas y claras mientras que la del precipitado presenta bandas más pronunciadas.
Esto nos lleva a pensar que en la última hay más presencia de sales, y como ya hemos comentado en
prácticas anteriores puede ser porque la muestra esté contaminada.
Compara la masa molecular de la hemoglobina obtenida con la teórica y discútelo. ¿Se habría
obtenido el mismo resultado en ausencia de agente reductor en el tampón de carga?
Encontramos una diferencia notoria entre los valores de la masa molecular (64kDa) con la obtenida
(32,88). Esto se puede deber al reductor que se ha empleado, el b-mercaptoetanol, para desnaturalizar
las proteínas y romper los puentes disulfuro, con el objetivo de facilitar su análisis y separación mediante
técnicas como la electroforesis.
En caso de que no se hubiera utilizado el reductor, posiblemente, el valor real y el obtenido serían
próximos aunque no idénticos, pues otros factores como la forma y la carga neta de la proteína, que
pueden influir en su movilidad en el gel.
Añadir proteasas puede facilitar la purificación del DNA, mejorar la calidad de los resultados de la
electroforesis y eliminar interferencias causadas por proteínas residuales, lo que optimiza los análisis
posteriores. Aunque en nuestro caso, a tener una muestra tan limitada se podría perder o degradar
completamente el DNA.
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Primer pocillo: patrón – proteína P + tampón misglicina (no B-mercaeptoetanol para mantener cisteínas)
Sobservando el resultado, si coinciden las bandas del primer y tercer pocillo, la proteína si puede
oligomerizar (sin presencia de cisteínas).
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Práctica VIII
1. Adjuntar los espectros de absorción de las muestras de DNA. Calcular la concentración original de
cada uno de ellos teniendo en cuenta la dilución realizada y la pureza según la proporción
A260/A280. Incluir estos resultados en la práctica III.
2. Adjuntar el espectro de la BSA. Calcular los coeficientes de extinción molar teórico y experimental.
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ABS280 BSA
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4. Adjuntar los espectros de las distintas formas de la hemoglobina con la leyenda apropiada.
1) METAHB
2) OXIHB
3) DESOXIHB
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La principal diferencia que encontramos es que el DNA, muestra una absorbancia máxima alrededor de
260 nm mientras que el espectro de absorción de BSA muestra una absorbancia máxima en el rango de
280 nm.
EL coeficiente más fiable es el teórico debido a que este puede ser erróneo simplemente por cálculos,
cosa que se puede solucionar con la repetición de las operaciones oportunas. Por otro lado el
experimental esta expuesto a otros fenómenos como son la contaminación o un pipeteo erróneo.
Compara los dos métodos y resultados utilizados en estas prácticas para calcular la concentración de
la hemoglobina dializada.
¿Los espectros de las formas de la hemoglobina son los esperados según la bibliografía?
Si, estos coinciden más o menos. Podemos ver unos picos similares:
Teniendo en cuenta estos espectros, ¿la hemoglobina dializada en qué forma está?
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Práctica IX
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- Representar Abscorr a 680nm frente a tiempo (min) para cada serie y ajustar los datos a una
recta.
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- Calcular las v0, que serán las pendientes de las rectas en el tramo en el que se mantiene
la linealidad (u.a./min) y completar la tabla.
Debido a una mala toma de datos, a contaminación o a algún factor externo, la gráfica tiene la
forma adecuada. Tendría que ser una gráfica logarítmica y no sale una recta. También podría ser
que los puntos que emos utilizado sean muy cercanos entre sí y por eso no llegamos a ver la zona
curva.
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Michaelis-Menten Lineweaver-Burk
Km 0,3462 0.6617
En general los gráficos y resultados parecen ser fiables. No encontramos ningún dato que sea exagerado.
La representación más fiable es la de Lineweaver-burk, ya que esta trabaja los valores exactos de -1/km y
de 1/vmax, es decir, el punto donde la recta corta al eje de abcisas y el punto donde corta con el eje de
coordenadas, respectivamente.
Podríamos hacer la de Eadie-Hofstee consta de v/[S] en función de v, la de Hanes: [S] en función de [S]/v
y la de Scatchard: v en función de v/[S]. V representa la velocidad y [S] concentración de sustrato.
¿Cuáles son los sustratos naturales de esta enzima? ¿Por qué se emplea el FFDS para cuantificar
su actividad?
La fosfatasa es una enzima que actúa sobre ésteres monofosfóricos en sustratos naturales. Para
cuantificar su actividad, se utiliza el sustrato FFDS, que al ser hidrolizado por la enzima, libera fenol y
fosfato. El fenol generado reacciona con el reactivo de Folin, que inicialmente es de color amarillo,
produciendo un cambio de coloración que se puede medir colorimétricamente. Cuanto más tiempo esté
la enzima en contacto con el reactivo de Folin, mayor será la cantidad de fenol formado, lo que
proporciona una medida indirecta de la actividad enzimática.
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7. TAREAS COMPLEMENTARIAS.
Para poder obtener los parámetros cinéticos kcat y kcat/Km de la fosfatasa alcalina en el
experimento realizado se debe expresar la velocidad en unidades de concentración molar de
producto por unidad de tiempo. Para ello, se ha realizado una recta patrón en las mismas
condiciones que el ensayo enzimático en la que se relaciona la concentración de fenol producida
en el volumen de ensayo (1.4 ml) con la absorbancia a 680 nm (figura adjunta. Sabiendo además
que la masa molecular del monómero de fosfatasa alcalina bovina es 70 kDa, calcula los
parámetros cinéticos mencionados.
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