Inmunofluorescencia 2
Inmunofluorescencia 2
Inmunofluorescencia 2
3°: Emisión de fluorescencia: un fotón se emite, lo que permite el retorno al fluoróforo al nivel
S0. A causa de la disipación de energía durante el estado excitado, la energía de este fotón es
menor.
La diferencia de energía es llamada “Stokes shift” (hνEX – hνEM) que es fundamental para la
sensibilidad de las técnicas de fluorescencia, ya que la emisión del fluoróforo permite
distinguirse del background.
Espectro de Fluorescencia
Para una intensidad satisfactoria de fluorescencia es preciso que se utilicen como excitadoras
radiaciones de longitud de onda correspondientes a los máximos de absorción del fluoróforo.
Los espectros de absorción y de fluorescencia de un fluoróforo en general están próximos ( más
cortas y más largas respectivamente). Esto es importante en la elección de los filtros.
Quenching de fluorescencia
En muestras biológicas el fluoróforo está en solución y puede interaccionar con otras
moléculas. Como consecuencia de esta interacción se puede producir una perdida de emisión
fluorescente. Es un proceso de desexcitatción no radiativa provocado por una molécula ajena al
fluoróforo (compuestos no fluorescentes), que recibe el nombre de quencher. Al proceso se lo
denomina "quenching" de la fluorescencia
Fluoróforos
Generalmente son compuestos heterocíclicos o hidrocarbonos poliarómaticos: moléculas rígidas
(varios niveles a los cuales pueden ser excitados; en el retorno, al no rotar no emite calor y sí luz)
Rodamina 6G
Rodamina B
Isotiocianato
fluoresceína
Fluoresceína
Fuente luminosa: coincidente con espectro de absorción del fluorocromo. Que no llegue al
ocular (UV perjudica la retina) Luz monocromática o no.
Filtros:Excitador: Transparente a cortas bloqueando más largas. Barrera: Transparente a
largas bloqueando cortas. Se coloca entre el objeto y el observador.
Inmunofluorescencia
Clínica (Diagnósticos)
Utilidades
Investigación (inmunohistoquímica, inmunofluorescencia)
Conjugados
Compuestos fluorescentes + Anticuerpos = Conjugados
Un buen conjugado debe tener: Fluorescencia intensa
Reacción específica con los antígenos
Depende de: Calidad y concentración de los Acs en el suero
Propiedades de la sustancia fluorescente
Modificaciones que ambos pueden sufrir en el acople
También influyen: Intensidad de marcación
Homogeneidad de marcación
Presencia en el conjugado de otras moléculas marcadas
Anticuerpos
Intensidad de marcación
Marcación excesiva:
Disminución del PI de las proteínas
Alteraciones en las propiedades inmunológicas de los anticuerpos (6 ó 7 moléculas de
fluoresceína/ molécula de Ac es el límite máximo)
Quenching de fluorescencia (disminución del rendimiento de emisión)
Homogeneidad de marcación
Sensibilidad
Método enzimático Método fluorescencia
Resolución
Biotina/Avidina (o estreptavidina)
Avidina/estreptavidina se marcan
Ac se purifica Conjugación a biotina con fluoróforo o enzima
AP
AP
AP
Para tejidos que expresan biotina: Agregar estreptavidina al tejido + Enzima biotinilada
(debería dar negativo)
Bloqueo con avidina + 3 biotinas en tejidos que expresan y luego inicio con Ac 1°
Enzima Ventaja Desventajas Recomendado
Anticuerpo 2°
Anticuerpo 1°
Anticuerpo 1°
Antígenos Antígenos
3° Capa: complejo
PAP de la especie A 3° Capa: Inmunoglobulina
2° Capa: Ac
antimarcador obtenida en A
contra Ig de A
2° Capa: Ac
contra Ig de A
1° Capa: Ac contra
1° Capa: Ac contra x en especie A
x en especie A
Importante: Permeabilizar
Tb se fija con formamida y se permeabiliza con Tritón X100
Controles????