ANALISIS PENGAWET

DALAM SEDIAAN FARMASI

DENGAN KCKT DAN KLT
Ardhea Pramesti Safira Indriati
Athalia Theda Tanujaya Syifa Rizki Nabila
Dwi Rana Farrasanti Tri Hastuti Septiarini
Felmina Lathifatuzzahra Vega Mylanda
Maria Juanita
PENDAHULUAN
 DEFINISI PENGAWET

• Pengawet antimikroorganisme adalah zat yang ditambahkan pada sediaan obat

untuk melindungi sediaan tersebut terhadap kontaminasi mikroorganisme.
• Bahaya dari pencemaran mikroorganisme, baik bakteri, jamur atau khamir terdapat
dimana-mana selama pembuatan, pengemasan, penyimpanan, dan penggunaan obat,
dimana manusia, lingkungan (ruang, udara) bahan obat dan bahan pembantu, alat-
alat kerja seperti mesin-mesin dan bahan pengemas primer merupakan sumber
kontaminasi utama.
 DEFINISI PENGAWET

Pengawet dalam bidang farmasi bertujuan untuk mencegah pertumbuhan

mikrooganisme. Pengawetan merupakan persoalan yang kompleks, dimana setiap
produk harus diseleksi. Efektivitas suatu pengawet tergantung beberapa faktor
antara lain:
• Bahan dalam sediaan
• Variasi atau jenis mikroorganisme yang ada
• pH dan tipe wadah
 KLASIFIKASI

Zat pengawet dapat diklasifikasikan menjadi dua macam, yakni

pengawet antimikroba dan antioksidan.
• Antimikroba
• Antifungal.
• Antibakterial.

• Antioksidan
• True antioxidants
• Reducing agent
• Antioxidants sinergysts
GOLONGAN SENYAWA PENGAWET
ASPEK YANG PERLU DIPERHATIKAN
DALAM PEMILIHAN PENGAWET
 PENGGUNAAN PENGAWET

Pengawet tunggal
• Misal asam benzoat; nipagin

Pengawet campuran
• Sinergisme / potensiasi
• Memperluas spektrum pengawet
• Mengurangi dosis pengawet
• Sistem heterogen
• Memperkecil koefisien partisi/ mencegah migrasi pengawet ke fasa minyak
• Potensiasi efek pengawet
 FAKTOR YANG
BERPENGARUH
1. pH SEDIAAN  DERAJAT DISOSIASI
2 KELARUTAN & KOEFISIEN PARTISI
3. ZAT LAIN DALAM SEDIAAN
• surfaktan
• anti mikroba Interaksi
• adsorben
4. SISTEM SEDIAAN
5. PENGENCERAN
6. WADAH
 PEMILIHAN PENGAWET
• CHECK KOMPONEN DALAM SEDIAAN
• Sumber pencemar
• Sumber enersi mikroba: Protein, Gum, Selulosa)
• Senyawa berefek anti mikroba (bahan aktif/ bahan lain)
• KEASAMAN SEDIAAN (pH)
• Pertumbuhan mikroba
• Disosiasi Pengawet
• KEMUNGKINAN INTERAKSI
• KOEFISIEN PARTISI (P<: C>: Propilen
• PENGAWET BEBAS
 PERSYARATAN PENGAWET
• Spektrum aktivitas luas
• Lebih bersifat bakteriosida dp. Bakteriostatik
• Tidak bersifat toksik, iritan atau sensitisasi;
• Sangat larut dalam air krn mikroba tumbuh dalam fase
air/ berair;
• Tercampurkan dengan wadah dan bahan lain;
• Stabil dan efektif pada rentang pH luas
• Tidak berwarna dan tidak berbau;
• Mempunyai retensi aktivitas terhadap sejumlah besar
mikroba;
MEKANISME AKSI PENGAWET
 MEKANISME

Memodifikasi permeabilitas membran sel dan kebocoran isi sel (lisis

parsial)
Pengawet akan
mengganggu Lisis dan kebocoran sitoplasma sel
pertumbuhan,
multiplikasi, dan Koagulasi konstituen sitoplasma secara ireversibel (misalnya
metabolisme mikroba presipitasi protein)
melalui beberapa
Penghambatan metabolisme sel, seperti mengganggu sistem enzim
mekanisme, yaitu: atau penghambatan sintesis dinding sel

Oksidasi konstituen sel

Hidrolisis
 CONTOH PENGAWET

• Asam benzoat (0,1-0,2%)

• Natrium benzoat (0,1-0,2%)
• Alkohol (15-20%)
• Fenilmerkuri nitrat dan asetat (0,002-0,01%)
• Fenol (0,1-0,5%)
• Kresol (0,1-0,5%)
• Klorobutanol (0,5%)
• Benzalkonium klorida (0,002-0,01%)
• Kombinasi metilparaben dan propilparaben (0,1-0,2%)
 KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

Kromatografi Cair Kinerja

Tinggi adalah teknik
pemisahan campuran yang
didasarkan atas
perbedaan distribusi dan
komponen-komponen
campuran tersebut antara
fase diam dan fase gerak.
KCKT merupakan teknik
yang paling cepat dan baik
digunakan untuk analisa
zat
 KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

Kegunaan Prinsip
Fase gerak akan dialirkan melalui kolom
• Pemisahan berbagai senyawa organik dengan bantuan pompa, lalu sampel
maupun anorganik, ataupun spesimen diinjeksikan sehingga sampel akan terbawa
biologis. bersama dengan fase gerak ke dalam kolom
• Analisis ketidakmurnian (impurities). dan terjadi pemisahan komponen sampel.
Komponen sampel dengan interaksi yang kuat
• Analisis senyawa-senyawa yang tidak dengan fase diam akan tertahan terlebih dahulu
mudah menguap (nonvolatil). pada fase diam, sedangkan komponen dengan
• Isolasi dan pemurnian senyawa. interaksi yang lemah dengan fase diam akan
keluar terlebih dahulu sehingga akan terdeteksi
• Pemisahan senyawa-senyawa dalam oleh detektor dan direkam dalam bentuk
jumlah kecil. kromatogram.
 KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

Kelebihan Kekurangan
• Sistem pemisahannya memiliki kecepatan, Jika sampel yang dianalisis sangat kompleks,
efisiensi, dan kepekaan yang tinggi resolusi yang baik akan sulit diperoleh
• Waktu analisis singkat
• Menghindari terjadinya
dekomposisi/kerusakan bahan yang
dianalisis
• Dapat menggunakan berbagai macam
detektor
• Kolom dapat digunakan kembali
 JURNAL METODE HPLC UNTUK
PENENTUAN KETOPROFEN DAN
PENGAWET SECARA SIMULTAN DALAM
FORMULASI GEL

Dwi Rana Farrasanti 1606892604

Felmina Lathifatuzahra 1606924436
Tri Hastuti Septiarini 1606874721
 PENDAHULUAN

• Ketoprofen (KET) adalah obat antiinflamasi non-steroid (NSAID) dengan sifat analgesik dan antipiretik yang
digunakan untuk pengobatan rheumatoid arthritis, osteoarthritis, ankylosing spondylitis dan gout

• Beberapa prosedur analisis telah dibuat untuk menganalisis ketoprofen pada berbagai formulasi sediaan farmasi.
Prosedur-prosedur ini termasuk capillary zone electrophoresis, Spektrofotometri UV, HPLC, Potensiometri, dan lain-
lain. Farmakope Eropa merekomendasikan titrasi asam-basa untuk menganalisis ketoprofen dalam zat,
Spektrofotometri UV untuk penentuannya dalam kapsul, dan Liquid Chromatography untuk penentuannya dalam
gel.
• Metil 4-hidroksibenzoat (metil paraben) dan propil 4-hidroksibenzoat (propil paraben) dikenal sebagai bahan
pengawet yang digunakan terutama untuk sifat bakterisidal dan fungisida yang dimilikinya. Paraben adalah
sekelompok alkil ester asam p-hidroksibenzoat, yang memiliki profil toksisitas rendah dan riwayat penggunaan yang
panjang dari sejak dulu. Penggunaan metil paraben bersifat toksik pada konsentrasi yang lebih tinggi karena efek
estrogeniknya. Aktivitas estrogenik paraben meningkat se panjang gugus alkil dan diketahui bahwa propil paraben
juga.memiliki efek estrogenik sampai tingkat tertentu.

• Penentuan zat-zat ini dalam obat-obatan dan kosmetik penting dalam pengendalian kualitas, terutama mengingat
banyaknya laporan reaksi alergi yang disebabkan oleh bahan pengawet. Salah satu metode untuk penentuan
pengawet, baik yang di dalam suatu sediaan maupun yang tidak, adalah dengan metode HPLC atau HPLC-MS.
 ALAT-BAHAN DAN METODE

1. Bahan kimia dan Reagen

• Disiapkan standar Ketoprofen, metil & propil paraben yang dibeli dari Sigma-Aldrich.
• Disiapkan Gel Ketoprofen 2,5% yang mengandung mengandung 1% metil paraben dan 0,1% propil paraben,
yang dapat dibeli secara komersil.
• Disiapkan LC-grade methanol dan acetonitrile yang disuplai oleh Merck.
2. Instrumentasi dan Sistem Kromatografi
Pemisahan secara kromatografi dilakukan pada sistem HPLC modular LC-10A Shimadzu, yang diatur dengan
pompa LC-10A, pelarut DGU-3A, injektor Rheodyne, kolom oven CTO-10A, SPD-M10A dilengkapi dengan
detector UV dan CTO-10A. Fase diam menggunakan LiChrosorb C18 (250mm x 4,6mm). Komponen dipisahkan
secara isokratik dengan fase gerak methanol:asetonitril (15:35) dan 1,5% larutan sodium asetat pada laju alir
1ml/min.Analisis dilakukan dari suhu sekitar dan volume injeksi adalah 20 μl. Detektor UV diatur pada 240 nm
 PREPARASI LARUTAN STANDARD

• Larutan Standard A : Larutan disiapkan dengan melarutkan 20 mg Metil

paraben pada methanol di dalam labu ukur 50 ml.
• Larutan Standard B : Larutan disiapkan dengan melarutkan 20 mg Propil
paraben pada methanol di dalam labu ukur 100 ml.
 PREPARASI SAMPEL

2 ml Ketoprofen gel yang mewakili 50 mg Ketoprofen, 20 mg metil paraben, dan 2 mg propil paraben dimasukkan ke
dalam labu ukur 20 ml. Sepuluh ml metanol ditambahkan dan labu ditempatkan dalam ultrasonic bath selama 20 menit.
Setelah pendinginan pada suhu kamar, labu diisi dengan metanol hingga batas volume, kemudian sampel disentrifugasi
pada 2000 rpm selama 10 menit. Lima ml sentrifugat bening dipindahkan ke labu volumetrik 25 ml, dan diisi dengan
fase gerak hingga batas volume. Setelah filtrasi melalui filter membran 0,45 mm, alikuot larutan sampel diinjeksikan ke
dalam kolom HPLC.
Validation Procedure
Accuracy

Robustness Specificity

Prosedur
validasi

Linearity
Precision
and range
 SPECIFICITY

• Pengujian ini dilakukan untuk mengetahui adanya analit pada campuran zat.

• Spesifisitas dari metode dievaluasi dengan menguji gangguan dari eksipien dalam bentuk sediaan farmasi yang
disiapkan dalam bentuk larutan plasebo.

• Hasil :

Dalam kromatogram larutan blanko tidak terdapat peak pengganggu yang dapat dilihat dari waktu retensi pada puncak
yang diuji, hal ini menandakan bahwa metode ini dapat digunakan untuk mengidentifikasi dan kuantifikasi simultan
untuk ketoprofen dengan adanya bahan pengawet dalam formulasi sediaan topikal gel.
 LINEARITY AND RANGE

• Ditentukan pada enam tingkat konsentrasi dengan rentang dari

• 125 – 1000 μg/ml untuk ketoprofen
• 50 – 400 μg/ml untuk metilparaben
• 5 – 40 μg/ml untuk propilparaben
• Hasil
 PRESISI

• Presisi intraday (pengulangan) dihitung menggunakan dua konsentrasi ketoprofen (250, 500 μg / ml),
metil paraben (100, 200 μg / ml) dan propil paraben (10, 20 μg / ml) dalam rangkap tiga
menggunakan metode yang diusulkan. Ketepatan antar hari (reproduktifitas) diulangi tiga kali pada
tiga hari yang berbeda untuk analisis dua konsentrasi yang berbeda (250: 100: 10, 500: 200: 20 ug /
ml) untuk obat yang dianalisis.
• Hasil :

Presisi Nilai% RSD dapat dilihat pada Tabel 3 untuk KET, MP dan PP ditemukan berada dalam
kisaran 0,32 hingga 0,87 yang menunjukkan pengulangan yang baik dan reproduktifitas dari
prosedur analitik yang dilakukan
 AKURASI

• Akurasi metode dievaluasi dengan teknik penambahan standar, yang dilakukan

dengan penambahan jumlah ketoprofen murni dan kedua paraben dengan

konsentrasi gel yang diketahui dan dianalisis dengan metode yang diusulkan

dalam rangkap tiga.

 ROBUSTNESS

• Ketangguhan metode adalah ukuran kapasitas untuk tetap tidak terpengaruh oleh variasi kecil
dalam parameter metode dan memberikan indikasi keandalannya selama penggunaan normal.
Kuatnya prosedur analitik dipelajari dengan berbagai parameter yang disengaja seperti panjang
gelombang analitik (± 2 nm) dan laju aliran (± 0,2 ml / menit). Reproduksibilitas kolom-ke-kolom
juga diperiksa dengan menggunakan C18 dengan dimensi yang sama.
• Hasil :

Ditemukan bahwa urutan dan resolusi elusi untuk kedua komponen tidak secara
signifikan dipengaruhi oleh variasi kecil dari kondisi. Hasil dari studi tentang kekokohan
metode itu dapat dilihat pada table 5
 KESIMPULAN

Metode HPLC tervalidasi yang dikembangkan terbukti sederhana,

spesifik, akurat, tepat, sensitif dan kuat. Ini dapat ditunjukkan dengan

berhasilnya metode ini digunakan untuk analisis rutin ketoprofen pada

gel tanpa ditemukan adanya gangguan dari berbagai eksipien.

 KLT (KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS)

• Kromatografi lapis tipis merupakan metode pemisahan fisikokimia yang didasarkan atas penyerapan,
partisi (pembagian), atau gabungannya. Prinsip pemisahan senyawa dengan KLT adalah pemisahan
berdasarkan perbedaan kepolaran antara analit (sampel) dan eluen.

• KLT adalah jenis kromatografi planar yang menggunakan plat logam yang dilapisi adsorben sebagai fase
diam, dan dielusidasi menggunakan pelarut tunggal atau pelarut kombinasi sebagai fase gerak dalam
suatu chamber

• Syarat penggunaan :

- Dibutuhkan sampel dan standar yang cukup murni.

- Penempatan standar dan sampel yang akurat dan konsisten ke atas lempeng dalam jumlah kecil serta ukuran
bercak yang kecil dan hampir sama
TUJUAN KLT

Untuk memeriksa komposisi campuran secara cepat.

Untuk menentukan kondisi percobaan kromatografi kolom.

Untuk mengetahui kesempurnaan suatu reaksi.

Untuk mengidentifikasi suatu obat, ekstrak tanaman, preparat

biokimia.

Untuk mendeteksi kontaminan, pemalsuan, dan lain-lain.

KOMPONEN KLT
 KELEBIHAN KLT
• Kekurangan KLT adalah memerlukan
• Peralatan sederhana.
tambahan waktu untuk prosedur pembuatan
• Waktu yang dibutuhkan cukup lempeng, kecuali telah tersedia lempeng yang
singkat (15-60 menit). diproduksi secara komersial.
• Jumlah zat yang diperiksa cukup
kecil.
• Tidak memerlukan ruang yang
besar dan teknik pengerjaannya
juga sederhana.
ANALISIS PENGAWET DENGAN KLT

• Kromatografi planar dengan

plat dan chamber
• Fase diam : Adsorben yg
berupa lapisan di plat
• Fase gerak : Pelarut / Eluen
• Dapat dilakukan oleh kedua jenis
KLT yaitu normal phase dan reverse
phase
• Peningkatan akurasi: TLC scanner
(Detektor)
JURNAL ANALISIS PENGAWET
DENGAN KLT
INTRODUCTION
 INTRODUCTION

• Loratadin  antihistamin H1 generasi II. Ciri khas: saat digunakan, efek sedasi yang
ditimbulkankecil karna hanya jumlah kecil dari obat yang dapat masuk ke BBB
• Loratadine umumnya tersedia dalam tablet dan sirup dengan pengawet yang berbeda-
beda
• Loratadine biasanya membahas formulasi dengan produk degradasi dalam campuran
dengan pengotor atau dengan obat lain
• KLT terlah banyak digunakan untuk penentuan loratadine sendiri maupun bersama
pengotor atau pseudoefedrin
• Jurnal kali ini ingin membahas analisis simultan loratadine dan bahan pengawet yang
umum yaitu natrum benzoat dan campuran metil paraben dengan propil paraben
dalam obat sirup
EXPERIMENTAL
 BAHAN DAN REAGEN

• Loratadine
• Bahan pengawet (sodium benzoate, methylparaben, dan propylparaben)
• Pereaksi lain yang digunakan dalam penelitian ini adalah produk Merck
• Sirup Claritine yang mengandung 1 mg loratadine per mL sirup dan sodium
benzoate 1 mg per mL sebagai pengawet
• Sirup Loratadine yang mengandung 1 mg loratadine per mL sirup dan
methylparaben 1 mg per mL dan propylparaben 0,1 mg per mL sebagai
pengawet
 PERSIAPAN LARUTAN STANDAR

• Sirup plasebo adalah larutan propilen glikol (4,5 mL), gliserol (1,5 mL), asam sitrat (1,5 mL of 5% aqueous
solution) dan sakarosa (5 g) dalam air (25 mL)

• Larutan stok loratadine (1 mg per mL), methylparaben (1 mg per mL), dan propylparaben (0,1 mg per mL)
disiapkan dalam etanol dan larutan stok sodium benzoate (1 mg per mL) disiapkan dalam asam
asetat:etanol dengan perbandingan 1:15 (v / v)

• Larutan standar untuk kalibrasi dalam rentang konsentrasi 0,15-0,35 mg per mL (loratadine,
methylparaben dan sodium benzoate) dan 0,015-0,035 mg per mL (propylparaben) disiapkan dengan
mengencerkan larutan stok dengan etanol.

• Sehingga 2 μL mencakup rentang 0,3-0,7 μg per band untuk loratadine, methylparaben dan sodium
benzoate dan rentang 0,03-0,07 μg per band untuk propylparaben.
 ANALISIS SIRUP LORATADINE

• Sirup (2,5 mL) dipindahkan ke labu terkalibrasi 10 mL dan

ditambahkan etanol hingga mencapai tanda kalibrasi.
 KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

• Kromatografi dilakukan pada plat TLC 20 cm × 10 cm yang dipotong dari plat aluminium 20 cm × 20 cm yang di pra-
preparasi dengan silika gel 60 F254 (Merck).
• Larutan standar dan sampel (2,0 μL) ditotolkan pada plat (15 mm dari bawah) dengan menggunakan perangkat aplikasi
Camomat (Muttenz, Swiss) Nanomat II.
• Plat dimasukkan ke dalam chamber
• Fasa gerak yang digunakan untuk campuran loratadine dan sodium benzoate adalah n-butil asetat, karbon tetraklorida,
asam asetat dan asetonitril dengan perbandingan 3: 6: 0,2: 3 (v / v) (fase gerak S1)
• Fasa gerak yang digunakan untuk campuran loratadine, methylparaben dan propylparaben adalah etil asetat, n-heksana,
metanol, ammonia dan diethylamine dengan perbandingan 1: 4: 0,8: 0,4: 2 (v / v) (fase gerak S2)
• Setelah itu, plat dikeringkan
• Bercak di scan dengan absorbansi linier pada 240 nm (loratadine dan sodium benzoate) atau 275 nm (loratadine,
methylparaben dan propylparaben) dengan menggunakan Camag TLC Scanner II dengan sistem komputer dan Cats
software (V.3.15)
• Area puncak digunakan untuk kuantitatif
RESULT AND DISCUSSION
HASIL DENSITOMETRI
 HASIL DENSITOMETRI

• pilihan n-butil asetat-karbon tetraklorida-asam asetat-asetonitril 3: 6: 0,2: 3 (v / v) 

memungkinkan resolusi loratadine yang memuaskan (jarak migrasi 52,5 mm, RF 0,47) dan
natrium benzoat (jarak migrasi 62,9 mm, RF 0,60).

• fase gerak baru, etil asetat-n-heksana-metanol –Ammonia – diethylamine 1: 4: 0.8: 0.4: 2 (v /

v)  meningkatkan hasil identifikasi loratadin (jarak migrasi 70,5 mm, RF 0,69) dan dan
pemisahan paraben yang lebih rendah (jarak migrasi metilparaben dan propilparaben masing-
masing adalah 39,3 mm dan 45,1 mm. ; Nilai RF 0,30 dan 0,38).
 HASIL DAN PEMBAHASAN

• Plat KLT juga dideteksi di bawah sinar UV

• Loratadin, metilparaben, dan propilparaben dikuantifikasi pada 275 nm, yaitu pada maksimum
penyerapan loratadine dan di mana absorbansi metilparaben dan propilparaben cukup tinggi.

• Loratadin dan natrium benzoat dalam campuran kedua dikuantifikasi pada 240 nm, di mana
kedua zat memiliki serapan yang sama.

• Panjang gelombang ini dipilih karena absorbansi natrium benzoat yang sangat rendah dalam
kisaran panjang gelombang yang mendekati maksimum penyerapan loratadine. Dengan cara
ini dimungkinkan untuk mengukur kedua komponen campuran dalam satu langkah.
 KURVA KALIBRASI

• Plot kalibrasi diperoleh dalam kisaran konsentrasi 0,3-0,7 mg per band untuk loratadine, sodium benzoate, dan methylparaben, dan 0,03-0,07 mg per

band untuk propylparaben.

• Hubungan antara luas puncak dan jumlah zat kromatografi diperoleh dengan analisis regresi linier.

• Larutan stok kalibrasi disiapkan dalam etanol kecuali untuk larutan stok natrium benzoat yang disiapkan dalam asam asetat-etanol 1:15 (v / v), karena

natrium benzoat memiliki kelarutan yang rendah dengan etanol.

• Larutan stok kalibrasi untuk natrium benzoat diperoleh dengan mengencerkan larutan stok dengan etanol yang mengandung 0,6-2% asam asetat.

• Untuk mengkonfirmasi adanya perbedaan Rf asam benzoal karena pengaruh asam asetat, maka dilakukan uji konfirmasi pembandingan. Dua seri kontrol

dengan konsentrasi natrium benzoat yang sama seperti pada seri kalibrasi disiapkan. Konsentrasi asam asetat dalam semua larutan dalam seri pertama

adalah 2% sedangkan dalam larutan dari seri kedua adalah dua kali lebih tinggi dari pada larutan kalibrasi (mis. 1,2-4%). Hasil yang diperoleh

mengungkapkan bahwa jumlah asam asetat yang berbeda ini hampir tidak berpengaruh pada data kalibrasi atau nilai RF untuk natrium

benzoat.
KURVA KALIBRASI
 UJI KETAHANAN
Variasi Perlakuan Hasil
Suhu Variasi antara 22-28˚C Tidak mempengaruhi pemisahan

Suhu di bawah 18˚C  resolusi loratadin

dan natrium benzoate cukup buruk
Saturasi Chamber Tidak berpengaruh pada campuran
loratadine, metilparaben, dan
propilparaben

Memperkecil Rf natrium benzoate (0,53)

Perbedaan Chamber Tidak ada perubahan signifikan pada Rf

Jarak elusi 85, 90, dan 95 mm
 KESIMPULAN

Metode ini akurat, sederhana, dan cepat

Preparasi sampel sirup  sederhana

Memungkinkan pengukuran densitometri langsung tanpa

isolasi
 REFERENSI
• Popović, G., Čakar, M., & Agbaba, D. (2007). Simultaneous determination of loratadine
and preservatives in syrups by thin-layer chromatography. Acta Chromatographica, (19),
161–169.