Efecto Antimicrobiano de Canela y Clavo en Patogenos (Articulo Cientifico)
Efecto Antimicrobiano de Canela y Clavo en Patogenos (Articulo Cientifico)
Efecto Antimicrobiano de Canela y Clavo en Patogenos (Articulo Cientifico)
56 doi: http://dx.doi.org/10.18684/BSAA(15)56-65 ISSN - 1692-3561 ISSN - 1909-9959 Vol 15 No. 1 (56-65) Enero _ Junio 2017
RESUMEN
Recibido para evaluación: 10 de Septiembre de 2015. Aprobado para publicación: 28 de Marzo de 2016.
Correspondencia: [email protected]
Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial
Vol 15 No. 1 (56-65) Enero _ Junio 2017 57
ABSTRACT
The use of spices with antimicrobial properties has been very important
in the food industry. The aim of this work was to study the antimicro-
bial effect of clove and cinnamon on the pathogens Salmonella spp.,
Escherichia coli and Staphylococcus aureus using the agar diffusion
method, and double dilutions in broth. The extracts of cinnamon and
clove studied under the agar diffusion method, caused no antimicrobial
effect on Salmonella spp, while in its highest concentrations (100 y 150
mg/mL) if they showed an antimicrobial effect on E. coli and S. aureus,
classified as sensitive. In the methodology of double dilutions in broth,
it was determined that for S. aureus ATCC ® 29213TM the CMI and CMB
were 512 μg/mL and 4096 μg/mL respectively and E. coli O157:H7 the
CMI and CMB were 2048 μg/mL and 4096 μg/mL.
PALABRAS CLAVE:
RESUMO Especias, Difusión en agar,
Salmonella spp., Escherichia coli,
O uso de especiarias com propriedades antimicrobianas tem tido gran- Staphylococcus aureus.
de importância na indústria de alimentos. O objetivo deste trabalho foi
estudar o efeito antimicrobiano de cravo e canela em patogênico Sal- KEYWORDS:
monella spp., Escherichia coli e Staphylococcus aureus, utilizando o Spices, Agar diffusion,
método de difusão em ágar, e diluições duplas em caldo. Os extratos de Salmonella spp., Escherichia coli,
canela e cravo estudadas pelo método de difusão em ágar, não causou Staphylococcus aureus.
nenhum efeito antimicrobiano em Salmonella spp, enquanto em suas
concentrações mais elevadas (100 y 150 mg/mL) se mostrou um efeito PALAVRAS-CHAVE:
antimicrobiano em E. coli e S. aureus, classificadas como sensíveis. Especiarias, ágar, Salmonella
Na metodologia de diluições duplas em caldo, determinou-se que o S. spp., Escherichia coli,
aureus ATCC para o 29213TM CMI e CMB foram 512 μg/ml e 4096 μg/ Staphylococcus aureus.
mL, respectivamente, e Escherichia coli O157: H7, o MIC e CMB foram
2048 μg/ml e 4096 μg/mL.
INTRODUCCIÓN
a los antibióticos y a las drogas tóxicas hidrófobas [3, el crecimiento de más del 50% de las bacterias del
4, 5]. De igual forma, el uso de antimicrobianos como estudio, de hecho los clavos y la canela, inhibieron
conservantes también, ha sido de gran importancia, al entre el 75 y el 100% de las cepas bacterianas utili-
permitir alargar la vida de los productos de anaquel, zadas. El objetivo del presente trabajo fue estudiar el
evitando la colonización por microorganismos alterantes. efecto antimicrobiano del clavo y la canela sobre los
Un amplio rango de sistemas antimicrobianos naturales patógenos Salmonella spp. E. coli y Staphylococcus
ha sido desarrollado a partir de microorganismos, plan- aureus utilizando el método de difusión en agar, y
tas y animales, muchos de ellos ya se han empleado diluciones dobles en caldo.
para la conservación de alimentos y otros están siendo
investigados para ser usados en estos [6].
MÉTODO
El uso de diversos ingredientes con características
antimicrobianas como la sal, el azúcar, el vinagre y Materia primas
las especias han tenido gran relevancia en la indus-
tria alimenticia [7]. Unas de estas sustancias con Las astillas de canela y paquetes de clavo, se com-
esas características son los aceites esenciales (AE) praron en Mercado Central de Cereté, Córdoba. Se
y sus componentes cuyas propiedades antibacte- mezclaron seis gramos de cada especia en un frasco
rianas están evidentemente relacionadas con su tapa rosca y se les adicionó 200 mL de etanol al 70%
carácter lipofílico, lo que lleva a la acumulación en v/v [13]. Se forró el recipiente con papel aluminio para
las membranas y posteriormente, a eventos asocia- evitar la degradación de los posibles compuestos fo-
dos, como el agotamiento de la energía. Presentan tosensibles presentes en la matriz alimentaria. Se dejó
un efecto antibacteriano contra las bacterias Gram- actuar el solvente a 45ºC por dos días, luego se filtró la
negativas, dado que ellas poseen una membrana solución para la separación de las fases, la líquida fue
externa rica en lipopolisacáridos que le proporciona rotaevaporada a una temperatura que no sobrepasó
una superficie hidrofílica [8, 9, 10, 11]. Las espe- a la de ebullición del disolvente. El extracto obtenido
cias como la canela y el clavo han sido utilizadas fue transferido a viales forrados con papel aluminio
en los alimentos no solo por su sabor, sino tam- y almacenados a 4ºC hasta llevar a cabo los análisis
bién, como medicamentos y conservantes [1]. Las de actividad antimicrobiana.
especias también estimulan el apetito mediante el
aumento de la salivación, y preservan los alimentos Actividad antimicrobiana
por sus propiedades antimicrobianas y antioxidan-
tes. En el mundo, diferentes países, utilizan más o Para la determinación del efecto antimicrobiano se
menos 400 especias, principalmente, para mejorar utilizaron dos metodologías, la propuesta por [14,
el sabor y la palatabilidad de los alimentos, esto se 15] de difusión en agar y la propuesta por CLSI (an-
demostró en un estudio de Billing y Sherman [12] tes NCCLS) en la que se determinó la Concentración
los cuales evaluaron el uso de 43 especias en 4.578 Mínima Inhibitoria (CMI), Concentración Mínima
recetas a base de carne procedentes de 36 países Bactericida (CMB) y la curva de letalidad.
y el por qué las personas las utilizan y llegaron a la
conclusión de que en los países de clima caliente, Difusión en Agar. De los cultivo de las cepas de
la proporción de recetas con especias, el número de estudio: Staphylococcus aureus, Escherichia coli
estas utilizadas en cada receta, el número total de y Salmonella spp, con un tiempo de incubación de
ellas, y el uso de la mayoría fueron superiores que 18 a 24, se hizo el inoculo con una concentración
en los países de clima frio. En donde, en países con de 0,5 patrón de McFarland suspendidas en solu-
clima caliente, se utilizaron más el ajo, la cebolla, la ción salina del medio de cultivo. Previamente, se
pimienta, la canela, el comino que en los de clima tomaron discos estériles sumergidos en 20 µL del
frio. Por otra parte, las comidas con sabores pican- extracto de clavo y canela diluido en 25% v/v de di-
tes y con fuerte adición de especias tienen mayor metilsulfoxido (DMSO) en concentraciones de 150,
poder antimicrobiano sobre los microorganismos 100, 50 y 25 µg/mL, los cuales se dejaron secar por
patógenos. Estos mismos autores compararon las 12 horas. Los discos impregnados se colocaron en
propiedades antimicrobianas, de 30 especias y la superficie del medio y el compuesto se dejó di-
resumieron el espectro antibacteriano de cada es- fundir, se incubó a 37°C durante 24 horas. Se utilizó
pecia y observaron que el 80% de ellas inhibieron ampicilina 10 μg/mL como control positivo y nega-
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tivo la oxacillin 5 μg/mL. Se ejecutaron los ensayos la concentración que arrojó la CMI, la mitad y cuatro
en dos fechas con tres repeticiones cada uno. En veces esta., cuadro 2. Se inoculó en cajas con agar
esta fase se aplicó un análisis descriptivo obtenién- nutritivo por estrías 10 µL a partir de los cultivos
dose la media y la desviación estándar. La actividad bacterianos a las 0, 2, 4, 8, y 24 horas, incubándose
antibacteriana se evaluó midiendo el diámetro de la a 37°C durante 24 horas.
zona de inhibición formado alrededor de los discos.
Tubos 1* 2 3 4 5 6 Control
[µg/mL] 4096 2048 1024 512 256 128 + -
bacteria Caldo
Microorganismo
Concentración
S. aureus E. coli
Mínima
Volumen Volumen
Inhibitoria Concentración Concentración
Stock MH Stock MH
CMI 512 50 µL 450 µL 2048 50 µL 450 µL
½ CMI 256 25 µL 475 µL 1024 25 µL 475 µL
4 CMI 2048 200 µL 300 µL 8192 200 µL 300 µL
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Cuadro 3. Zona de inhibición (mm) del extracto de clavo y canela sobre Salmonella spp., E. coli y S. aureus
Día 1 Día 2
Nomenclatura Salmonella spp. E. coli S. aureus Salmonella spp. E. coli S. aureus
Zona de inhibición (mm)**
Concentración 150 mg/mL - 15 15 - 10 15
Concentración 100 mg/mL - 10 13 - 10 14
Concentración 50 mg/mL - 9 - - 9 -
Concentración 25 mg/mL - 9 - - 9 -
Control oxacillin (5 Mg) - - - - - -
Control ampicilina (10 Mg) 20 18 17 15 14 18
Control etanol 70 % - - - - - -
Control DMSO al 25 % - - - - - -
polifenoles que con los solventes puros (agua y etanol). Sin embargo, frente a E. coli y S. aureus, se observa
También Agafonova et al. [18], investigaron con hojas el efecto antimicrobiano con la mayor concentra-
de Limoniastrum monopetalum y observaron que se ción de 150 mg/mL, esto es posible por la presen-
incrementaba el poder de extracción de los compuestos cia de alcaloides, oxhidrilos fenólicos, y el eugenol
fenólicos, cuando se adicionaba un 20% v/v de agua a presente en el clavo, datos reportados por Khan et
otros solventes como el metanol, acetona o etanol. al., [24], en cambio, en la canela el efecto antimi-
crobiano lo proporciona el aldehído cinámico [25].
Difusión en agar. En el cuadro 3 se puede observar los
resultados en mm producidos por las zonas de inhibi- En cuanto a S. aureus los resultados de este estudio
ción para cada microorganismo frente a los extractos. concuerdan, con lo reportado por Garcia-Caramillo et
Esta medición relaciona la sensibilidad del microorga- al., [23] quienes demostraron que el extracto de clavo y
nismo al extracto, según el diámetro del halo, así; los canela, presenta un efecto antibacteriano principalmente
microorganismos se clasifican en: no sensibles (d< 8 contra S. aureus. Lo anterior, se debe a que el aceite
mm), sensibles (9 mm<d<14 mm), muy sensibles (14 esencial de la canela contiene una alta concentración de
mm<d<19 mm) y extremadamente sensibles (d>20 trans-cinamaldehído, que es el componente en mayor
mm) [19, 20]. Se puede observar que E. coli en el día 1 proporción, también presenta linalol, eugenol y otros
y S. aureus en el día 1 y 2, presentaron una sensibilidad compuestos fenólicos. Otros estudios, han identifica-
de 9 mm (restando 6 mm del disco) clasificándose como do al trans-cinamaldehído como el mayor componente
sensibles. Esta medición relaciona la sensibilidad del antibacterial del aceite esencial de esta especia. El ci-
microorganismo al extracto, según el diámetro del halo, namaldehído actúa inhibiendo las amilasas y proteasas
así; los microorganismos se clasifican en: no sensibles provocando el deterioro de la pared y un alto grado de
(d< 8 mm), sensibles (9 mm < d < 14 mm), muy lisis celular [26].
sensibles (14 mm < d< 19 mm) y extremadamente
sensibles (d > 20 mm) [21] En el caso de las bacterias Gram negativas sensi-
bles, así, como de las Gram positivas, los aceites
En el caso, de la Salmonella spp se observa que para esenciales se introducen a través de los lípidos de la
ninguna de las concentraciones estudiadas se obtuvo un membrana celular, alterando su estructura y hacién-
efecto antimicrobiano, resultados similares obtuvieron [22, dolas más permeables. Como consecuencia tiene
23] quienes trabajaron con extractos acuosos de clavo y lugar una fuga de iones y de otros contenidos ce-
canela sin obtener ningún grado de inhibición conside- lulares, de forma más o menos intensa, que puede
rable. Estos últimos encontraron que los componentes llevar a la muerte celular [26].
activos de los extractos de clavo y canela son similares
entre sí, haciendo suponer que su acción antibacteriana Goñi et al., citado por [27] estudiaron la actividad
también lo es. antimicrobiana por contacto directo y en la fase de
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vapor del clavo y la canela , observaron halos de in- La evaluación de la técnica de microdilución en tubo
hibición de 18 y 20 mm por contacto directo para E. arrojó una CMI de 512 µg/mL para el Staphyloccoc-
coli y S. aureus respectivamente, en nuestro caso, cus aureus ATCC® 29213TM en la concentración de
los resultados dieron por debajo de las citadas. Es- 512 µg/mL. Moleyar y Narasimhm Citado por Seow
tudios hechos por Smith-Palmer et al., [28] con los et al., [32] estudiaron el efecto inhibitorio de la mez-
aceites esenciales de 21 plantas entre las que fi- cla del cinamaldehido y el eugenol, componentes
guran el clavo y la canela de forma independiente, fenólicos principales del clavo y la canela, obser-
mostraron halos de inhibición de 14 mm para E. coli varon inhibición del S. aureus entre 250 y 500 μg/
y S. aureus, siendo estos resultados más cercanos mL, y cuando se evaluaron individualmente, en esas
a los arrojados en este experimento. mismas concentraciones no observaron la misma
inhibición del crecimiento. Lu et al., [33], confirma-
Hernández et al., [29] afirman que en los diversos ron que el aceite de canela es un agente antibacte-
resultados obtenidos en los estudios que aplican el riano fuerte. Por otro lado [27] mostraron valores de
método de difusión en agar se tienen que tener en CMI en fase de vapor de la mezcla de clavo y canela
cuenta factores tales como; diámetro del disco, can- de 54 µg/mL, valor mucho más bajo que el reportado
tidad del aceite esencial adicionado, cantidad espe- por este estudio.
cífica de microrganismos y la fase de crecimiento
en que este se encuentre; pues cualquier cambio El mecanismo de acción de los AE contra bacterias
o descuido en estos factores originará variabilidad Gram positivas, se basa en que los componentes
en los resultados y diferencias significativas con lo del aceite destruyen la pared celular y la membra-
reportado en la literatura. na citoplasmática, lo que resulta en el derrame del
citoplasma y su coagulación, además, de inhibir la
CMI, CMB y Curva de Letalidad de los microrganis- síntesis de ADN, ARN y proteínas [33].
mos frente al extracto de Clavo y Canela. Esta meto-
dología fue dirigida inicialmente a la determinación de Los resultados de la curva de letalidad se obser-
la actividad de los antibióticos pero ha sido modificado van en la figura 1; en 256 µg/mL no se da ninguna
para determinar la actividad de los AE; adaptándose inhibición, lo que si se da en 512 µg/mL y la eliminación
para determinar la actividad antimicrobiana de los AE del crecimiento se observa en 2048 µg/mL a las 24
y los extractos de plantas [30, 31]. La CMI se define horas. Estos resultados contrastan con las pruebas
como la menor concentración del extracto que produ- hechas para CMB del S. aureus que mostro el punto
ce el 90% de reducción en el crecimiento de las colo- de corte en 4096 µg/mL; explicándose quizás por una
nias. La CMB se define como la mínima concentración serie de factores que influyen en la estimación de la
del extracto que produce al menos un 99,9% de reduc- actividad antimicrobiana de los AE, entre los que se
ción en el crecimiento de las colonias [20]. encuentran la temperatura, el pH, el potencial óxido-
Figura 1. Curva de Letalidad del Staphylococcus aureus frente al extracto de clavo y canela.
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reducción y la actividad de agua, según Hernández ejercen efecto antagónico sobre el crecimiento de E.
et al., [31]; el método utilizado, tipo y volumen del coli y sinérgico en la inhibicion de L. monocytogenes,
medio, concentración y edad del inoculo, el tipo de B. cereus y Y. enterocolitica.
cepa del microorganismo en estudio, la temperatu-
ra, el tiempo, la atmósfera de incubación y el sol- El eugenol, componente mayoritario del aceite de
vente o agente dispersante. clavo de olor, y el cinamaldehido, componente de la
canela, actúan inhibiendo la producción de enzimas
Para la Escherichia coli O157:H7, la CMI arrojo un extracelulares, tales como amilasas y proteasas, lo
resultado de 2048 µg/mL, siendo la menor concen- que provoca el deterioro de la pared y un alto grado
tración del extracto que produjo el 90% de reducción de lisis celular. La adición de los AE presenta una
en el crecimiento. Goñi et al., [29] reportaron valores buena respuesta a la inhibición al crecimiento de
de CMI para esta bacteria de 90 µg/mL en la mezcla E. coli, es así como, los derivados fenólicos tales
en fase de vapor; y para los extractos independientes como carvacrol y eugenol provenientes del clavo
de clavo y canela de 27 y 18 µg/mL respectivamente, de olor y el tomillo, causan la desintegración de la
mostrando un resultado sinérgico, o sea, la actividad membrana en la E. coli y S. typhimurium [33].
conjunta es mayor que las suma de las actividades de
los dos antimicrobianos por separado. Esta afirmación Con respecto a la curva de letalidad de la Esche-
es opuesta a la de Lu et al., [33], quienes reportan richia coli O157:H7 que se observa en la figura
resultados antagónicos; es decir, en el caso, de E. Coli, 2; se evidencia que en la concentración 1024 y
la actividad conjunta de los extractos es menor que las 2048 µg/mL, no hubo inhibición del crecimiento,
suma de la actividad de los dos antimicrobianos por mientras que en la concentración 8194 µg/mL se
separado e indiferentes. Estos resultados tan diversos dio una constante inhibición desde el tiempo 0 hasta
están explicados, además, de los factores comentados la finalización del experimento a las 24 horas. La
por [29], por las diferencias en la estructura de la CMB del microrganismo se dio en la concentra-
canela o el clavo utilizado; pues según Delgado [34], ción de 4096 µg/mL, es decir, a esta es la más
la época y el lugar de recolección, la parte de la planta baja concentración del extracto de clavo y canela
utilizada y la etapa en la que se encuentre la planta, necesario para eliminar el 99% del inóculo inicial
determinaran la concentración de los componentes después de la incubación por 24 horas bajo condi-
mayoritarios en la especia; generalmente los aceites ciones estandarizadas. Esto puede explicarse por
esenciales de plantas que fueron cosechadas durante o la alta concentración de la misma y por la elevada
inmediatamente después de la floración poseen mayor viscosidad pues como se observa en la Cuadro
actividad antimicrobiana. Otro factor importante es el 6, esta solución se preparó a partir del extracto
sitio de producción de los compuestos, en algunos madre, con un muy bajo porcentaje del diluyen-
casos pueden sintetizarse en toda la planta; en otras te CMH, por lo que es una suspensión altamente
especies puede haber producción selectiva de meta- lipídica, que impide el normal desarrollo del mi-
bolitos en cada órgano de la planta, como ocurre con crorganismo.
la canela (Cinnamomum zeylanicum Blume), que en
la corteza del tallo produce altas concentraciones de En los alimentos se ha demostrado que se necesitan
aldehído cinámico, en las hojas predomina el eugenol más cantidades de AE que la que se ha necesitado
y en la corteza de la raíz el camfor. en experimentos previos in vitro, lo cual se explica
por factores intrínsecos del propio alimento (grasa,
Algunas investigaciones de actividad antimicrobiana proteína, agua, antioxidantes, conservantes, pH, sal
de aceites AE de clavo y canela combinados [20, y otros aditivos) y por factores extrínsecos, como la
27, 35], se realizaron para evaluar el crecimiento de temperatura, pH, tipo de envasado y características
bacterias Gram-negativas: Escherichia coli, Yersinia del microorganismo. La matriz física de los alimen-
enterocolitica, Pseudomonas aeruginosa y Salmo- tos también puede limitar la actividad antibacteriana
nella choleraesuis y cuatro bacterias Gram positivas de los AE. La extrapolación de los resultados de las
pruebas in vitro a los alimentos es por lo tanto, difí-
Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Baci- cil y siempre es más alto en los alimentos [36].
llus cereus y Enterococcus faecalis. Se determinó que
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Figura 2. Curva de Letalidad del Escherichia coli frente al extracto de clavo y canela.
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