Purificación Celular

• PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS
ESQUEMA DE tejido cultivo celular

vegetal bacterias PREPARACIÓN
PURIFICACIÓN animal levaduras EXTRACTO
células mamíferos
DE UNA crudo
PROTEÍNA homogeneizar
fraccionamiento subcelular
extracto proteico PURIFICACIÓN

PROTEÍNA
precipitación con sal
diálisis
cromatografía intercambio iónico
cromatografía gel filtración
PROTEÍNA
HOMOGENEIZACIÓN
TEJIDO: Animal  homogeneizador (politron)
N2 líquido + mortero
Vegetal  arena + mortero
CULTIVO: Bacterias  detergente + sonicar (ultrasonidos)

Levaduras  bolas de vidrio + vórtex (agitación fuerte)
Células mamífero  detergente + rascar (scraper)
Tejido animal Tejido vegetal Bacterias Levaduras
Células mamífero
FRACCIONAMIENTO SUBCELULAR
CENTRIFUGACIÓN
DIFERENCIAL
El homogenato
es centrifugado
repetidas veces a
velocidades crecientes
sedimentándolo
progresivamente y
realizando un
fraccionamiento
diferencial de sus
componentes
Citosol
ZONAL:
El homogenato se aplica
sobre un gradiente de
densidad (sacarosa,
cloruro de cesio) y al
aplicar la fuerza
centrífuga, cada
componente se desplaza
hasta la zona de
densidad igual a la suya.
PRECIPITACIÓN CON SAL
H2 O
Sales: Sulfato amónico (NH4)2 SO4 H2 O H2 O H2O

Cloruro sódico Na Cl
H2 O H2 O
Deshidratación  precipitación de Prot. A: Prot. B:

+ apolar, + polar,
proteínas. hidrofóbica hidrofílica
+ sal (NaCl)
(poca)
H2O
Separar proteínas por polaridad. Na H2 O Na
Permite concentrar las proteínas. Cl Cl

INSOLUBLE SOLUBLE
Se usa mucho en los primeros pasos de
la purificación de proteínas.
sobrenadante
Prot. B
precipitado
Prot. A
DIÁLISIS
Membrana semipermeable (poros de diámetro determinado)
moléculas menores que el poro  fuera

moléculas mayores que el poro  dentro
Desalar muestras por diferencia de presión osmótica dentro y fuera del saco de
diálisis.
sal  fuera (< poro)

proteínas  dentro (> poro)
• SEPARACION y PURIFICACIÓN
• Masa o tamaño de la proteína

• Carga eléctrica
• Afinidad
• Cromatografía: diferentes compuestos

pueden distribuirse en distinto grado entre
diferentes fases: una estacionaria y una
móvil.
CROMATOGRAFÍA DE GEL FILTRACIÓN
PROPIEDAD: Tamaño (y forma)
SOPORTE  Resina de micropartículas esféricas

formadas por polímeros hidrofílicos: dextrano,
agarosa, poliacrilamida o mezcla de ellos
Tamaños de poro  intervalo o rango de

fraccionamiento. FASE MÓVIL
Sephadex G25: 1000 – 5000 Da

Sephadex G200: 5000 – 250000 Da
MICROPARTÍCULAS
F. ESTACIONARIA
F. ESTACIONARIA  LÍQUIDA solvente acuoso
(el mismo que el de la fase móvil) que se encuentra
dentro de micropartículas.
F. MÓVIL  LÍQUIDA solvente acuoso que

atraviesa la columna por los espacios intersticiales
(entre las micropartículas).
CROMATOGRAFÍA DE GEL FILTRACIÓN
Molec. GRANDES  RÁPIDAS
No penetran en los poros, avanzan con

mayor velocidad a través de los espacios
intersticiales (con f. móvil) y eluyen
primero
Molec. PEQUEÑAS  LENTAS
Ppenetran por los poros por lo que el

recorrido que han de realizar a traves de la
columna es mayor y avanzan con menor
velocidad (con f. estacionaria).
PERFIL DE ELUCIÓN
APLICACIÓN grande
MUESTRA pequeña
respuesta del detector

ELUCIÓN
1 2 3 4 5 6 7 8 9
fracción
CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO
PROPIEDAD: Interacciones electrostáticas (carga)
SOPORTE  Resina de micropartículas formadas por

polímeros sintéticos o naturales (dextranos, celulosas,
agarosa).
F. ESTACIONARIA  SÓLIDA Grupos con cargas FASE MÓVIL

iónicas unidos al soporte
Carga positiva (+)  intercambiadores de aniones (-):

cromatografía intercambio aniónica
Carga negativa (-) intercambiadores de cationes (+):
cromatografía intercambio catiónica F. ESTACIONARIA
F. MOVIL  LÍQUIDA Solvente que anula la interacción MICROPARTÍCULAS

electrostática.
2 posibilidades: Gradientes de pH  cambio de carga

de las moléculas de la muestra
Gradientes iónicos (salinos)  competencia
por grupos electrófilos
Las proteínas
presentan carga a
distintos pH
debido a sus pI
CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO
•Gradiente de pH
•Gradiente salino Molec. MENOR CARGA (+)  RÁPIDAS
Son desplazadas más fácilmente por la f.móvil.
Molec. MAYOR CARGA (+)  LENTAS
Son retenidas por los grupos cargados

iónicamente de la f. estacionaria.
PERFIL DE ELUCIÓN
q+
APLICACIÓN Q+
MUESTRA
+
Na+
ELUCIÓN
-
Cromatografía 1 2 3 4 5 6 7 8 9
catiónica fracción
CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD
PROPIEDAD: Interacciones específicas entre dos moléculas

hormona-receptor
proteína-metal o cofactores como ATP
antígeno-anticuerpo
SOPORTE  Matriz de micropartículas hidrofílicas sin

FASE MÓVIL
carga, con rigidez, inerte y estable (agarosa, acrílica).
F. ESTACIONARIA  SÓLIDA Ligandos (grupos

químicos) específicos unidos a la matriz
-- Comerciales: Concavalina A  une glicoproteínas

Proteína A  une IgG (anticuerpos)
-- No comerciales: anclaje covalente ligando - matriz F. ESTACIONARIA
MICROPARTÍCULAS
F. MÓVIL  LÍQUIDA Solución que anula o disminuye la
afinidad con el ligando de la fase estacionaria.
-- Solución con el propio ligando  Molécula + ligando libre

-- Solución con algo que interacciona con el ligando  Molécula
CROMATOGRAFÍA
DE AFINIDAD
Molec. NO INTERACCIÓN  RÁPIDAS
No se unen al ligando de la fase estacionaria
Molec. INTERACCIÓN  LENTAS
Se unen al ligando de la fase estacionaria

Elución específica.
PERFIL DE ELUCIÓN
ELUCIÓN
LAVADO ESPECÍFICA
molécula
APLICACIÓN
MUESTRA
LAVADO
ELUCIÓN 1 2 3 4 5 6 7 8 9
ESPECÍFICA fracción

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extracto proteico PURIFICACIÓN

cromatografía intercambio iónico

cromatografía gel filtración

CULTIVO: Bacterias  detergente + sonicar (ultrasonidos)

Sales: Sulfato amónico (NH4)2 SO4 H2 O H2 O H2O

Deshidratación  precipitación de Prot. A: Prot. B:

Separar proteínas por polaridad. Na H2 O Na

Permite concentrar las proteínas. Cl Cl

moléculas menores que el poro  fuera

sal  fuera (< poro)

• Masa o tamaño de la proteína

• Cromatografía: diferentes compuestos

PROPIEDAD: Tamaño (y forma)

SOPORTE  Resina de micropartículas esféricas

Tamaños de poro  intervalo o rango de

Sephadex G25: 1000 – 5000 Da

F. MÓVIL  LÍQUIDA solvente acuoso que

No penetran en los poros, avanzan con

Molec. PEQUEÑAS  LENTAS

Ppenetran por los poros por lo que el

respuesta del detector

PROPIEDAD: Interacciones electrostáticas (carga)

SOPORTE  Resina de micropartículas formadas por

F. ESTACIONARIA  SÓLIDA Grupos con cargas FASE MÓVIL

Carga positiva (+)  intercambiadores de aniones (-):

F. MOVIL  LÍQUIDA Solvente que anula la interacción MICROPARTÍCULAS

2 posibilidades: Gradientes de pH  cambio de carga

Son desplazadas más fácilmente por la f.móvil.

Molec. MAYOR CARGA (+)  LENTAS

Son retenidas por los grupos cargados

PROPIEDAD: Interacciones específicas entre dos moléculas

SOPORTE  Matriz de micropartículas hidrofílicas sin

F. ESTACIONARIA  SÓLIDA Ligandos (grupos

-- Comerciales: Concavalina A  une glicoproteínas

-- Solución con el propio ligando  Molécula + ligando libre

No se unen al ligando de la fase estacionaria

Molec. INTERACCIÓN  LENTAS

Se unen al ligando de la fase estacionaria

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