INFORME 2 (S.aureus y Bacillus) - 1
INFORME 2 (S.aureus y Bacillus) - 1
INFORME 2 (S.aureus y Bacillus) - 1
PRÁCTICA Nº2
STAPHYLOCOCUS AUREUS Y
BACILLUS CEREUS.
FACILITADOR: PARTICIPANTES:
Ing.Molina Tedder Br Pierina Robles C.I 28.084.071
Curso: microbiología de alimentos Br Euskady Pinto C.I 30.361.824
Abril,2024
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OBJETIVOS
STAPHYLOCOCCUS AUREUS:
Objetivo General:
Observar mediante la técnica de recuento estándar en placas las colonias de
microorganismos presente en una muestra de alimento.
Objetivos específicos:
Aislamiento e identificación de Staphylococcus aureus
Confirmación a través de la prueba Bioquimica
BACILLUS CEREUS:
Objetivo General:
Aislamiento e Identificación de Bacillus Cereus
Objetivos Específicos:
Identificar mediante pruebas bioquímicas el microorganismo patógeno Bacillus Cereus
2
FUNDAMENTO TEÓRICO
STAPHYLOCOCCUS AUREUS
Staphylococcus aureus es una bacteria de gran importancia debido a su participación en
diferentes patologías (11), esto dado por la intervención de los distintos factores de virulencia
y patogenicidad, codificados por los diversos genes que son expresados a lo largo de su ciclo
de vida. Se conoce que este microorganismo es de difícil tratamiento y es capaz de colonizar
e invadir las células de su hospedero, lo cual es posible debido a su fisiopatología, donde se
encuentran mecanismos de resistencia como la formación de biopelícula las cuales crean una
matriz extracelular conformada principalmente por proteínas, poli actualmente conocido
como sacáridos y ácidos nucleicos. La formación de esta matriz causa que la interacción de
los antibióticos con las bacterias no se dé de manera adecuada generando fallas en los
tratamientos (10).
Esta bacteria está clasificada como un coco Gram positivo que se agrupa en racimos, β
hemolítico, catalasa y coagulasa positivo. Se describe que este microorganismo hace parte
de la flora normal de los seres humanos encontrándose principalmente en la piel, en la zona
nasofaríngea, pliegues inguinales y axilas (4). Sin embargo, este patógeno se caracteriza por
generar infecciones en piel y tejidos blandos (músculos, tendones, tejidos grasos, vasos
sanguíneos), invasión a dispositivos médicos (13), (5) y también ha sido relevante en las
enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) (14).
3
realizan pruebas como la de la enzima coagulasa, donde a diferencia de las demás especies
de Staphylococcus, S. aureus es coagulasa positivo. Asimismo, se puede utilizar la prueba de
catalasa, donde S. aureus por medio de esta enzima produce oxígeno, al interactuar con el
peróxido de hidrogeno (7). También se utilizan diferentes medios de cultivo, el más
comúnmente usado para la identificación y crecimiento de este microorganismo es el agar
Baird Parker, en este medio las colonias de S. aureus se ven de color negro debido a la
reducción del telurito y con un halo transparente a causa de la acción lipolítica sobre la yema
de huevo. En el agar salado manitol, el cual posee agentes inhibidores para que solamente
haya crecimiento de las diferentes especies de Staphylococcus, las colonias típicas de S.
aureus son de color amarillo debido a la fermentación manitol, mientras que las especies de
Staphylococcus coagulasa negativa producen colonias de color rojo. Para la identificación de
cepas patógenas se utiliza el agar DNAsa ya que la actividad desoxirribonucleasa es
indicadora de patogenicidad; en este agar se estudia la capacidad del patógeno de hidrolizar
el ADN, lo cual se observa por la formación de halos transparentes en el medio (14).
La ICMSE concluyó que el agar Baird-parker es el que mejor se comporta como medio
selectivo para la enumeración de S. Aureus en los alimentos. Este medio contiene como
agente Inhibidor telurito potásico y cloruro de litio y como sistema indicador yema de huevo.
4
Después de 24-48 hrs de incubación a 37 0c, S. Aureus produce en el medio colonias negras
rodeadas de una zona clara (de 2-5 mm anchura), en el interior de esta zona hay otra opaca
más pequeña que sólo se desarrolla en la última fase de incubación, estas reacciones son muy
específicas de S. Aureus, pero deben hacerse unas pruebas de confirmación (reacción de la
coagulasa). Hayes (1993)
Para su identificación se realiza una siembra por punción y estría en agar nutritivo de
las colonias sospechosas. A partir de aquí se le realizan las siguientes pruebas bioquímicas:
1. Coagulasa (confirmativa) es una enzima estafilocócica que forma un complejo en la
prolombina en suero para desintegrar el fibrinógeno en fibrina, cuando se coloca S. Aureus
en un tubo con suero que contiene protombina y fibrinógeno este adquiere apariencia
gelatinosa.
3. Prueba de la termonucleasa:
a. Preparar una microlamina colocando en la superficie de un porta objeto 3ml de agar
DNA-AZUL TOLUIDINA cuando solidifique hacer orificios de 2mm de diámetro sobre la
superficie del mismo, con ayuda de una pipeta Pasteur
(10-12 orificios por lámina), remover los tacos de agar por aspiración.
b. A cada orificio se añade una gota de cultivo de germen en caldo cerebro corazón
previamente calentado en baño María a 1 00 0c por 15 min.
c. Incubar las láminas en una cámara húmeda durante 4 hrs a 35-370 c.
5
d. Observar la aparición de halos rosados que se extienden al menos 1 mm de la periferia
de loa orificios, indicando la positividad.
4. Prueba de la catalasa:
a. En una porta objeto colocar una gota de (H202) y luego añadir un poco de
inoculo.
b. Observar si hay desprendimiento de oxígeno, los S. Aureus son catalasa
positivos.
c. Prueba de la DNASA
d. En las placas de agar DNASA inocular el cultivo en estudio, haciendo una
estría sobre el agar Incubar las placas a 37 0 c por 24 hrs
e. Añadir (HCI) al In sobre la superficie del medio, la aparición de una zona clara
alrededor del cultivo revela la presencia de la desoxirribonucleasa.
5. Prueba de la Hemolisis:
a. Sembrar por estría en una placa de agar sangre, con un asa de procedente de
un cultivo de 24 hrs e incubar a 37 0 c por 24hrs.
b. Los S. Aureus productores de enterotoxinas son por lo general hemolfticos.
Si la prueba de la coagulasa o termonucleasa resultan positivo, se considera el
recuento presuntivo como confirmativo.
El número promedio de las placas se multiplica por 10 para obtener el número de
colonias por gr o ml de la dilución empleada.
Para obtener el número de colonias gr o ml del producto, se multiplica este resultado
por la dilución correspondiente.
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METODOLOGÍA
Parte Experimental
Procedimiento:
ESQUEMA
10 gr 1 ml 1 ml
(Queso Llanero)
7
P = Siembra por Profundidad
Muestra de Queso llanero
Agar Selectivo Staphylococcus
Incubar a 37 C por 24/48 h
Agar: Un ingrediente sólido que proporciona una superficie sólida y estable para el
crecimiento bacteriano.
Peptona: Una fuente de nutrientes para el crecimiento bacteriano.
Extracto de levadura: Un extracto de levadura que proporciona vitaminas y otros nutrientes.
Cloruro de sodio: Un ingrediente que ayuda a mantener el equilibrio osmótico en el medio.
Manitol: Un carbohidrato que algunos tipos de Staphylococcus pueden fermentar.
Rojo de fenol: Un indicador de pH que cambia de color cuando se produce fermentación de
manitol.
Cristal violeta: Un colorante que inhibe el crecimiento de bacterias Gram negativas y
permite el crecimiento selectivo de Staphylococcus.
8
OBSERVACIONES EXPERIMENTALES
Dilución Placa Colonias
10-1 1 120
2 107
1 35
10-2
2 59
1 7
10-3
2 4
Cálculos típicos
Formula
∑𝒄
𝑵=
𝑽 (𝒏𝟏 + 𝟎, 𝟏 ∗ 𝒏𝟐 )𝒅
𝟑𝟓 + 𝟓𝟗 + 𝟕 + 𝟒 𝟏𝟎𝟓
𝑵= = = 𝟒𝟕. 𝟕𝟐
𝟏(𝟐 + 𝟎, 𝟏 ∗ 𝟐) 𝟐, 𝟐
=4.772 × 101
9
DISCUSION DE RESULTADOS.
Los S. Aureus son cocos gram positivos presentes en el medio ambiente, agua, aire y
alimentos; se presentan con más frecuencias en derivados lácteos y con alto contenido de sal.
Bailey y Scott (2004).
En los quesos elaborados con leche sin pasteurizar, como el queso tipo telita, se produce
una alta contaminación durante el proceso de paleteo e hilado a que es sometida la cuajada,
posterior al periodo de cocción de la misma, mientras que en el queso blanco blando
elaborado con leche pasteurizada la contaminación ocurre post proceso del tratamiento
térmico.
Oyor R. menciona que los quesos frescos son considerados como un producto que
presenta alto riesgo alimentario debido a sus características intrínsecas y a que se elabora con
leche cruda, sin un tratamiento térmico previo, que favorece el crecimiento de
microorganismos patógenos como el S. aureus a niveles que permiten la formación de
enterotoxinas. Se considera que estas enterotoxinas estafilocócicas pueden detectarse a partir
de 104 IJFC/g, y que esta posibilidad se incrementa cuando las cargas de S. aureus se
encuentran en el orden de 106 UFC/g.
En la práctica se incubó las muestras por 62 horas,presento crecimiento entre los
rangos estimados, aunque las primeras muestras dieron incontables por ser la menos diluida
contenia mas cantidad del producto, se logró observar crecimiento de Staphylococcus aureus
en una muestra de queso blanco llanero, esto indica que la cantidad de bacterias de este tipo
en la muestra es normal a baja, considerando el tiempo.
Si no se detecta crecimiento de Staphylococcus aureus en una muestra de queso
blanco, significa que la cantidad de bacterias de este tipo es inferior al límite de detección
del método utilizado. Sin embargo, es importante tener en cuenta que la ausencia de
crecimiento de esta bacteria en una muestra no garantiza la inocuidad del producto.
Además, pueden existir algunos aditivos que se pueden agregar al queso blanco
para impedir el crecimiento de Staphylococcus aureus y otros microorganismos. Por ejemplo,
se pueden utilizar conservantes como los nitratos y nitritos, los cuales tienen propiedades
antimicrobianas y ayudan a prevenir el crecimiento de bacterias como Staphylococcus aureus
como pudo haber sido el caso de la muestra utilizada. (De Castro, 2013)
Otro aditivo como algunos ácidos orgánicos como el ácido láctico y el ácido acético
también pueden ser efectivos para inhibir el crecimiento de esta bacteria en el queso blanco.
Estos ácidos orgánicos se producen naturalmente durante el proceso de fermentación del
10
queso, pero también se pueden agregar de forma sintética para mejorar la conservación del
producto. (Chen, C. 2015).
El agar utilizado para el recuento de placas (agar S. Aureus) podría tener propiedades
inhibitorias para el crecimiento de Staphylococcus aureus. La composición del medio,
concentración de nutrientes o presencia de inhibidores selectivos podrían haber afectado el
desarrollo bacteriano. Así mismo también es fundamental revisar las condiciones de
incubación, como la temperatura y el tiempo. Staphylococcus aureus es conocido por su
capacidad de crecer a temperaturas específicas, generalmente entre 35-37 °C. Si las
condiciones no fueron las adecuadas, podría haber afectado el crecimiento bacteriano.
11
CONCLUSIONES
Los Staphylococcus aureus son cocos Gram positivos, presentes en el ambiente, agua,
aire y alimentos; se presentan con frecuencia en derivados lácteos y alimentos con alto
contenido de sal como los embutidos.
Datos epidemiológicos revelan que entre los años 1993 y 2000, Staphylococcus
aureus fue uno de los principales microorganismos causantes de brotes en Venezuela por
consumo de queso blanco.
12
El crecimiento de Staphylococcus aureus en los alimentos puede ser controlado
mediante medidas de higiene adecuadas, como la limpieza y la desinfección de los equipos
y superficies de procesamiento de alimentos. Además, se pueden utilizar aditivos y
conservantes naturales para inhibir el crecimiento de esta bacteria en los alimentos.
13
FUNDAMENTO TEÓRICO
BACILLUS CEREUS
14
Bacillus cereus es un bacilo Gram positivo, anaerobio facultativo y móvil debido a la
presencia de flagelos perítricos [3-8]; forma esporas resistentes a condiciones adversas del
medio, como altas temperaturas, deshidratación y radiación, y produce diversas toxinas que
contaminan gran variedad de alimentos [7]. Es capaz de crecer en un amplio rango de
temperaturas, desde los 4 °C a 48 °C, a pHs de 4,9 a 9,3 y soporta concentraciones de NaCl
en el medio hasta del 7 % [3]. Las esporas son resistentes a bajas condiciones de humedad y
a tratamientos térmicos como la pasteurización o procesos de cocción de los alimentos [10]
y al ácido clorhídrico presente en el estómago, lo que constituye un peligro potencial para la
salud humana [4].
15
microorganismo esporulados con una gran capacidad para sobrevivir en diferentes ambientes
y en condiciones de estrés [14].
16
Instituto Nacional para la Vigilancia de Medicamentos y Alimentos (invima), implementó la
Norma Técnica Colombiana ntc: 4679 versión 1 de 2006, que es una adopción modificada
de la norma ISO 7932:2004, por la cual se determina el procedimiento para el análisis y la
cuantificación de colonias de B. cereus en alimentos para humanos y animales [11].
17
METODOLOGÍA
Parte Experimental
Caldo Nitrato:
a) Luego de inoculado se incuban los tubos a 30°C por 18 a 24 horas
18
b) Se agregan los reactivos para la prueba de reacción de nitrito (0,1 ML) se
agitan los tubos y se observa el color, la aparición de un color rosado o rosa indica la
presencia de nitritos (prueba positiva). B. cereus reduce nitratos
Gelatina Nutritiva:
a) Se inoculan los tubos por punción, utilizando la aguja de platino y se incuban
a 30°C por 24 horas en posición vertical
b) Se registra la reacción B cereus la cual licúa ligeramente la gelatina
Caldo Glucosa Tamponado:
Movilidad:
a) Se siembra en Agar en un medio semisólido en picadura, si el microorganismo
es móvil crece por todo el medio
b) Se puede calcular el número más probable cuando se sospecha que el alimento
tenga menos de 10 UFC/ML. A partir de disoluciones decimales se siembran en: caldo
tripticasa a 31°C durante 48 horas, de los tubos en crecimiento se siembran en Mossel y se
confirma
19
ESQUEMA
Condimento comercial
El agar selectivo para Bacillus cereus es un medio de cultivo que se utiliza para la
identificación y enumeración de Bacillus cereus en alimentos y muestras ambientales.
20
El agar selectivo más comúnmente utilizado para Bacillus cereus es el agar selectivo para
Bacillus cereus y Listeria (BACILLUS CEREUS SELECTIVE AGAR BASE), que contiene
los siguientes componentes:
Este agar selectivo favorece el crecimiento de Bacillus cereus y ayuda a inhibir el crecimiento
de otros microorganismos que pueden estar presentes en la muestra. La presencia de Bacillus
cereus se detecta por la aparición de colonias de color blanco-amarillento, con un halo de
precipitación oscuro alrededor de la colonia.
21
OBSERVACIONES EXPERIMENTALES
Cálculos típicos
Formula
∑𝒄
𝑵=
𝑽 (𝒏𝟏 + 𝟎, 𝟏 ∗ 𝒏𝟐 )𝒅
𝟓𝟓 + 𝟐𝟏 + 𝟏𝟗 + 𝟑𝟎 𝟏𝟐𝟓
𝑵= = = 𝟓𝟔. 𝟖𝟏
𝟏(𝟐 + 𝟎, 𝟏 ∗ 𝟐) 𝟐, 𝟐
=5.681 × 101
22
DISCUSIÓN DE RESULTADOS
El condimento comercial se encuentra dentro del grupo denominado alimentos listos para el
consumo ya que no requieren tratamientos térmicos adicionales antes de ser ingeridos por el
consumidor. La calidad bacteriológica de este alimento depende de muchos factores
incluyendo la forma de conservarlo y la manipulación del mismo (Wogu et all., 2011).
Dicho todo esto, es importante mencionar que en la práctica realizada se lograron obtener los
resultados necesarios para el conteo de este microorganismo, esto pudo deberse a que los
condimentos a anlizar no están en condiciones inocuas para el consumo ya que presentan
gran crecimento de Bacillus cereus como fue en el caso de la muestra procesada (D. A.
McDowell et al. 2006).
La presencia de Bacillus cereus en condimentos comerciales plantea un desafío para la
industria alimentaria y los consumidores. Esta bacteria resistente, capaz de formar esporas
que sobreviven a condiciones adversas, puede contaminar los condimentos y provocar
intoxicación alimentaria.
23
CONCLUSIONES
Bacillus cereus es un patógeno que se localiza de forma común en el suelo y, por tanto, en
cultivos como legumbres, cereales o especias. En condiciones secas, como las habituales en
alimentos como arroz o recipientes de especias, Bacillus cereus puede permanecer en forma
de esporas.
24
RECOMENDACIONES
Contar con la presencia de dos mecheros para la realización de la práctica sería de mucha
importancia y utilidad ya que es esencial para garantizar la pureza de los cultivos, la
esterilizacion de los instrumentos, evitar la contaminación y crear un ambiente de trabajo
seguro y aséptico, además de que permitirá agilizar la realización de la práctica.
25
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
STAPHYLOCOCCUS AUREUS
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31
ANEXOS
BACILLUS CEREUS
32
33
STAPHYLOCOCCUS AUREUS
34
35