REPÚLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA

UNIVERSIDAD NACIONAL EXPERIMENTAL"SIMÓN RODRÍGUEZ"

NÚCLEO CANOABO - DR. FELIX ADAM
INGENIERÍA DE ALIMENTOS
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS

PRÁCTICA Nº2
STAPHYLOCOCUS AUREUS Y
BACILLUS CEREUS.

FACILITADOR: PARTICIPANTES:
Ing.Molina Tedder Br Pierina Robles C.I 28.084.071
Curso: microbiología de alimentos Br Euskady Pinto C.I 30.361.824

Abril,2024

1
 OBJETIVOS
 STAPHYLOCOCCUS AUREUS:
Objetivo General:
 Observar mediante la técnica de recuento estándar en placas las colonias de
microorganismos presente en una muestra de alimento.
Objetivos específicos:
 Aislamiento e identificación de Staphylococcus aureus
 Confirmación a través de la prueba Bioquimica

 BACILLUS CEREUS:
Objetivo General:
 Aislamiento e Identificación de Bacillus Cereus
Objetivos Específicos:
 Identificar mediante pruebas bioquímicas el microorganismo patógeno Bacillus Cereus

2
 FUNDAMENTO TEÓRICO
STAPHYLOCOCCUS AUREUS
Staphylococcus aureus es una bacteria de gran importancia debido a su participación en
diferentes patologías (11), esto dado por la intervención de los distintos factores de virulencia
y patogenicidad, codificados por los diversos genes que son expresados a lo largo de su ciclo
de vida. Se conoce que este microorganismo es de difícil tratamiento y es capaz de colonizar
e invadir las células de su hospedero, lo cual es posible debido a su fisiopatología, donde se
encuentran mecanismos de resistencia como la formación de biopelícula las cuales crean una
matriz extracelular conformada principalmente por proteínas, poli actualmente conocido
como sacáridos y ácidos nucleicos. La formación de esta matriz causa que la interacción de
los antibióticos con las bacterias no se dé de manera adecuada generando fallas en los
tratamientos (10).

Staphylococcus aureus es un microorganismo descubierto en 1880 por el cirujano

escocés Alexander Ogston (1844-1929), quien encontró que el pus producido en las heridas
quirúrgicas era generado por esta bacteria, al observar un absceso de uno de sus pacientes al
microscopio. Posteriormente, en 1882, Ogston le dio el nombre de "Staphylococcus", del
griego "Staphylo" que significa "racimo de uvas". Después, en 1884, el cirujano alemán
Anton J. Rosenbach (1842-1923) identificó dos cepas de Staphylococcus y las nombró de
acuerdo a las pigmentaciones que producían: Staphylococcus aureus, del latín "aurum" para
el pigmento color oro, y Staphylococcus albus (actualmente conocido como Staphylococcus
epidermidis), del latín "albus" para el pigmento blanco (8).

Esta bacteria está clasificada como un coco Gram positivo que se agrupa en racimos, β
hemolítico, catalasa y coagulasa positivo. Se describe que este microorganismo hace parte
de la flora normal de los seres humanos encontrándose principalmente en la piel, en la zona
nasofaríngea, pliegues inguinales y axilas (4). Sin embargo, este patógeno se caracteriza por
generar infecciones en piel y tejidos blandos (músculos, tendones, tejidos grasos, vasos
sanguíneos), invasión a dispositivos médicos (13), (5) y también ha sido relevante en las
enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) (14).

Para la identificación de esta bacteria en el laboratorio, inicialmente se puede utilizar

microscopia, donde se observan cocos Gram positivos. Para la confirmación de la especie se

3
realizan pruebas como la de la enzima coagulasa, donde a diferencia de las demás especies
de Staphylococcus, S. aureus es coagulasa positivo. Asimismo, se puede utilizar la prueba de
catalasa, donde S. aureus por medio de esta enzima produce oxígeno, al interactuar con el
peróxido de hidrogeno (7). También se utilizan diferentes medios de cultivo, el más
comúnmente usado para la identificación y crecimiento de este microorganismo es el agar
Baird Parker, en este medio las colonias de S. aureus se ven de color negro debido a la
reducción del telurito y con un halo transparente a causa de la acción lipolítica sobre la yema
de huevo. En el agar salado manitol, el cual posee agentes inhibidores para que solamente
haya crecimiento de las diferentes especies de Staphylococcus, las colonias típicas de S.
aureus son de color amarillo debido a la fermentación manitol, mientras que las especies de
Staphylococcus coagulasa negativa producen colonias de color rojo. Para la identificación de
cepas patógenas se utiliza el agar DNAsa ya que la actividad desoxirribonucleasa es
indicadora de patogenicidad; en este agar se estudia la capacidad del patógeno de hidrolizar
el ADN, lo cual se observa por la formación de halos transparentes en el medio (14).

De los organismos no esporulados, los Staphylococcus son algunos de los más

resistentes. Algunos soportan 60 0 c durante media a una hora y fenol al 1% durante 1 5 min.
Permanecen variables después de refrigeración o de estar desecados durante varios meses.
En el hombre, el reservorio principal de Staphylococcus es la nariz. A partir de aquí,
estos organismos llegan directa o indirectamente a la piel (sobre todo en las áreas con mayor
vellosidad) y heridas. Aunque el número de portadores nasales varía, es aproximadamente
de un 50 por 100 en los adultos y a veces superior a esta cifra en loa niños. A partir de aquí
los organismos llegan a través del aire y polvo a los vestidos y otros partes, y así contaminan
los alimentos. Las dos procedencias de organismos que contaminan los alimentos son los
portadores nasales y los individuales con manos y brazos infectados con diversos forúnculos,
y que tiene acceso a los alimentos. Los Staphylococcus se desarrollan entre un amplio margen
de temperaturas (12-45'c), pero la óptima es de 37 'c. Todas las especies crecen bien en los
medios ordinarios de laboratorio.

La ICMSE concluyó que el agar Baird-parker es el que mejor se comporta como medio
selectivo para la enumeración de S. Aureus en los alimentos. Este medio contiene como
agente Inhibidor telurito potásico y cloruro de litio y como sistema indicador yema de huevo.

4
 Después de 24-48 hrs de incubación a 37 0c, S. Aureus produce en el medio colonias negras
rodeadas de una zona clara (de 2-5 mm anchura), en el interior de esta zona hay otra opaca
más pequeña que sólo se desarrolla en la última fase de incubación, estas reacciones son muy
específicas de S. Aureus, pero deben hacerse unas pruebas de confirmación (reacción de la
coagulasa). Hayes (1993)
Para su identificación se realiza una siembra por punción y estría en agar nutritivo de
las colonias sospechosas. A partir de aquí se le realizan las siguientes pruebas bioquímicas:
1. Coagulasa (confirmativa) es una enzima estafilocócica que forma un complejo en la
prolombina en suero para desintegrar el fibrinógeno en fibrina, cuando se coloca S. Aureus
en un tubo con suero que contiene protombina y fibrinógeno este adquiere apariencia
gelatinosa.

2. Prueba para la producción de coagulasa:

a) Hacer subcultivos a partir de las colonias seleccionadas sobre el agar simple
biselado
b) Incubar a 37 'c por 24 hrs.
c) Realizar una coloración de gram para observar y descubrir la morfología de S.
Aureus.
d) Incubar en caldo infusión cerebro corazón durante 20-24 hrs a 35-37 0 c.
e) Añadir 0,1 ml de los cultivos resultantes a 0,3 ml de plasma de conejo en tubos
pequeños e incubar a 35-37 0 c por 4hrs o más.
f) A las 4 hrs examinar los tubos para ver si el medio aparece coagulando y caso
negativo también pasada las 24 hrs de incubación.

3. Prueba de la termonucleasa:
a. Preparar una microlamina colocando en la superficie de un porta objeto 3ml de agar
DNA-AZUL TOLUIDINA cuando solidifique hacer orificios de 2mm de diámetro sobre la
superficie del mismo, con ayuda de una pipeta Pasteur
(10-12 orificios por lámina), remover los tacos de agar por aspiración.
b. A cada orificio se añade una gota de cultivo de germen en caldo cerebro corazón
previamente calentado en baño María a 1 00 0c por 15 min.
c. Incubar las láminas en una cámara húmeda durante 4 hrs a 35-370 c.

5
 d. Observar la aparición de halos rosados que se extienden al menos 1 mm de la periferia
de loa orificios, indicando la positividad.

4. Prueba de la catalasa:
a. En una porta objeto colocar una gota de (H202) y luego añadir un poco de
inoculo.
b. Observar si hay desprendimiento de oxígeno, los S. Aureus son catalasa
positivos.
c. Prueba de la DNASA
d. En las placas de agar DNASA inocular el cultivo en estudio, haciendo una
estría sobre el agar Incubar las placas a 37 0 c por 24 hrs
e. Añadir (HCI) al In sobre la superficie del medio, la aparición de una zona clara
alrededor del cultivo revela la presencia de la desoxirribonucleasa.
5. Prueba de la Hemolisis:
a. Sembrar por estría en una placa de agar sangre, con un asa de procedente de
un cultivo de 24 hrs e incubar a 37 0 c por 24hrs.
b. Los S. Aureus productores de enterotoxinas son por lo general hemolfticos.
Si la prueba de la coagulasa o termonucleasa resultan positivo, se considera el
recuento presuntivo como confirmativo.
El número promedio de las placas se multiplica por 10 para obtener el número de
colonias por gr o ml de la dilución empleada.
Para obtener el número de colonias gr o ml del producto, se multiplica este resultado
por la dilución correspondiente.

6
 METODOLOGÍA

Parte Experimental

Procedimiento:

1. Se pesaron asépticamente 10 gramos de una muestra de queso llanero y se añadió a una

solución de agua peptonada (90 ml) homogenizando convenientemente, correspondiendo
esta a la dilución 10−1 y luego se realizaron las diluciones necesarias 10−2 y 10−3
2. Se pipeteó 1 ml de la muestra o subdiluciones en placas de Petri.
3. Se añadieron a las placas 15-20 ml de agar para recuento en placas (agar S. Aureus).
4. El inoculo se mezcló con el agar mediante rotación en la placa.
5. Una vez solidificado el agar, las placas se invirtieron e incubaron a 35-37 °C durante un
período de 24 horas.
6. Se contaron las colonias que dieron positivo, las cuales presentaban las siguientes
características: entre 30 y 30°C, color negro brillante, rodeadas de zonas claras en contraste
con el medio opaco, y fundido a 45 °C

ESQUEMA

10 gr 1 ml 1 ml

(Queso Llanero)

7
 P = Siembra por Profundidad
 Muestra de Queso llanero
 Agar Selectivo Staphylococcus
 Incubar a 37 C por 24/48 h

El agar selectivo para Staphylococcus es un medio de cultivo utilizado para el

aislamiento y la identificación de Staphylococcus aureus y otros tipos de Staphylococcus en
muestras clínicas y de alimentos. Este medio se compone principalmente de:

 Agar: Un ingrediente sólido que proporciona una superficie sólida y estable para el
crecimiento bacteriano.
 Peptona: Una fuente de nutrientes para el crecimiento bacteriano.
 Extracto de levadura: Un extracto de levadura que proporciona vitaminas y otros nutrientes.
 Cloruro de sodio: Un ingrediente que ayuda a mantener el equilibrio osmótico en el medio.
 Manitol: Un carbohidrato que algunos tipos de Staphylococcus pueden fermentar.
 Rojo de fenol: Un indicador de pH que cambia de color cuando se produce fermentación de
manitol.
 Cristal violeta: Un colorante que inhibe el crecimiento de bacterias Gram negativas y
permite el crecimiento selectivo de Staphylococcus.

8
 OBSERVACIONES EXPERIMENTALES
Dilución Placa Colonias

10-1 1 120

2 107

1 35
10-2

2 59

1 7
10-3

2 4

Cálculos típicos
Formula
∑𝒄
𝑵=
𝑽 (𝒏𝟏 + 𝟎, 𝟏 ∗ 𝒏𝟐 )𝒅

𝟑𝟓 + 𝟓𝟗 + 𝟕 + 𝟒 𝟏𝟎𝟓
𝑵= = = 𝟒𝟕. 𝟕𝟐
𝟏(𝟐 + 𝟎, 𝟏 ∗ 𝟐) 𝟐, 𝟐

=4.772 × 101

9
 DISCUSION DE RESULTADOS.

Los S. Aureus son cocos gram positivos presentes en el medio ambiente, agua, aire y
alimentos; se presentan con más frecuencias en derivados lácteos y con alto contenido de sal.
Bailey y Scott (2004).
En los quesos elaborados con leche sin pasteurizar, como el queso tipo telita, se produce
una alta contaminación durante el proceso de paleteo e hilado a que es sometida la cuajada,
posterior al periodo de cocción de la misma, mientras que en el queso blanco blando
elaborado con leche pasteurizada la contaminación ocurre post proceso del tratamiento
térmico.
Oyor R. menciona que los quesos frescos son considerados como un producto que
presenta alto riesgo alimentario debido a sus características intrínsecas y a que se elabora con
leche cruda, sin un tratamiento térmico previo, que favorece el crecimiento de
microorganismos patógenos como el S. aureus a niveles que permiten la formación de
enterotoxinas. Se considera que estas enterotoxinas estafilocócicas pueden detectarse a partir
de 104 IJFC/g, y que esta posibilidad se incrementa cuando las cargas de S. aureus se
encuentran en el orden de 106 UFC/g.
En la práctica se incubó las muestras por 62 horas,presento crecimiento entre los
rangos estimados, aunque las primeras muestras dieron incontables por ser la menos diluida
contenia mas cantidad del producto, se logró observar crecimiento de Staphylococcus aureus
en una muestra de queso blanco llanero, esto indica que la cantidad de bacterias de este tipo
en la muestra es normal a baja, considerando el tiempo.
Si no se detecta crecimiento de Staphylococcus aureus en una muestra de queso
blanco, significa que la cantidad de bacterias de este tipo es inferior al límite de detección
del método utilizado. Sin embargo, es importante tener en cuenta que la ausencia de
crecimiento de esta bacteria en una muestra no garantiza la inocuidad del producto.
Además, pueden existir algunos aditivos que se pueden agregar al queso blanco
para impedir el crecimiento de Staphylococcus aureus y otros microorganismos. Por ejemplo,
se pueden utilizar conservantes como los nitratos y nitritos, los cuales tienen propiedades
antimicrobianas y ayudan a prevenir el crecimiento de bacterias como Staphylococcus aureus
como pudo haber sido el caso de la muestra utilizada. (De Castro, 2013)
Otro aditivo como algunos ácidos orgánicos como el ácido láctico y el ácido acético
también pueden ser efectivos para inhibir el crecimiento de esta bacteria en el queso blanco.
Estos ácidos orgánicos se producen naturalmente durante el proceso de fermentación del

10
queso, pero también se pueden agregar de forma sintética para mejorar la conservación del
producto. (Chen, C. 2015).
El agar utilizado para el recuento de placas (agar S. Aureus) podría tener propiedades
inhibitorias para el crecimiento de Staphylococcus aureus. La composición del medio,
concentración de nutrientes o presencia de inhibidores selectivos podrían haber afectado el
desarrollo bacteriano. Así mismo también es fundamental revisar las condiciones de
incubación, como la temperatura y el tiempo. Staphylococcus aureus es conocido por su
capacidad de crecer a temperaturas específicas, generalmente entre 35-37 °C. Si las
condiciones no fueron las adecuadas, podría haber afectado el crecimiento bacteriano.

La presencia de contaminantes ambientales podría haber inhibido el crecimiento de

Staphylococcus aureus. La ausencia de crecimiento de Staphylococcus aureus en la siembra
puede deberse a una combinación de factores, incluyendo posibles errores en la técnica,
propiedades inhibitorias del medio de cultivo o condiciones de incubación inadecuadas. Es
esencial revisar cada paso del procedimiento y considerar las variables involucradas para
identificar la causa subyacente de la falta de crecimiento microbiano. Realizar pruebas
adicionales y replicar la siembra bajo condiciones controladas pueden ser necesarios para
obtener resultados más concluyentes.

11
 CONCLUSIONES

A pesar de la implementación de la técnica de recuento estándar en placas con el

propósito de observar y cuantificar las colonias de microorganismos en la muestra de
alimento, lamentablemente no se logró alcanzar dicho objetivo debido a la ausencia de
crecimiento microbiano en las placas de agar. Esta situación impidió la consecución de los
objetivos específicos planteados, que incluían el aislamiento e identificación de
Staphylococcus aureus y su confirmación mediante pruebas bioquímicas.

El poco crecimiento observado puede atribuirse a diversas variables, como posibles

errores en la técnica de siembra, condiciones ambientales inadecuadas, o la presencia de
inhibidores en el medio de cultivo. Aunque la ausencia de colonias limita la capacidad de
realizar el aislamiento e identificación específica de Staphylococcus aureus, este resultado
negativo también es informativo y señala la necesidad de revisar y ajustar los procedimientos
utilizados en la investigación microbiológica.

Los Staphylococcus aureus son cocos Gram positivos, presentes en el ambiente, agua,
aire y alimentos; se presentan con frecuencia en derivados lácteos y alimentos con alto
contenido de sal como los embutidos.

Staphylococcus aureus es un microorganismo que está presente de forma natural en

la leche y los productos lácteos y está a menudo asociado con las enfermedades transmitidas
por los alimentos debido a la capacidad de algunas cepas para producir enterotoxinas
termoestables (Nogueira et al., 2010).

Datos epidemiológicos revelan que entre los años 1993 y 2000, Staphylococcus
aureus fue uno de los principales microorganismos causantes de brotes en Venezuela por
consumo de queso blanco.

Staphylococcus aureus es una bacteria que se encuentra de forma natural en la

piel, fosas nasales y cavidad bucal de los animales y personas, que actúan como reservorios
y fuente de contaminación de los alimentos.

12
 El crecimiento de Staphylococcus aureus en los alimentos puede ser controlado
mediante medidas de higiene adecuadas, como la limpieza y la desinfección de los equipos
y superficies de procesamiento de alimentos. Además, se pueden utilizar aditivos y
conservantes naturales para inhibir el crecimiento de esta bacteria en los alimentos.

La detección de Staphylococcus aureus en los alimentos se realiza mediante métodos

de cultivo microbiológico, que pueden incluir la siembra en superficie o en profundidad,
dependiendo del objetivo y la muestra específicos.

13
 FUNDAMENTO TEÓRICO
BACILLUS CEREUS

Bacillus cereus es un microorganismo resistente a los procesos de cocción o

pasteurización de los alimentos [2]. Se encuentra en el ambiente de forma habitual y tiene el
potencial de contaminar fácilmente los alimentos por prácticas de manufactura deficientes,
lo cual puede propiciar condiciones adecuadas para su proliferación y desencadenar la
presentación de enfermedades transmitidas por alimentos (eta) al hombre [9]. La eta se
adquiere por el consumo de alimentos contaminados con agentes químicos o microbiológicos
y/o sus toxinas en cantidades determinadas que afectan la salud humana [17]. Entre los
agentes microbiológicos causantes de eta se encuentran bacterias, virus, hongos y parásitos;
estos pueden multiplicarse en el tracto gastrointestinal, lisarse, producir toxinas o invadir la
pared intestinal para alcanzar otros órganos o sistemas [9]. Además de B. cereus, otras
bacterias se han relacionado comúnmente a las etas, por ejemplo, Clostridium spp., Shigella
spp., Salmonella spp., Listeria Monocytogenes, Staphylococcus aureus y algunas especies de
enterobacterias [19]. Comparado con estos patógenos, para B. cereus existe un subregistro
de casos, lo que se debe probablemente a que su cuadro clínico es muy corto y por lo general,
las personas no acuden a los servicios de salud, ya que los síntomas pueden confundirse con
intoxicaciones ocasionadas por otras bacterias como Clostridium perfringes o
Staphylococcus aureus [21].

Bacillus cereus tiene una amplia distribución geográfica y se ha reportado causando

intoxicaciones en diferentes países como Estados Unidos [16], Finlandia, Bulgaria, Noruega,
Reino Unido y Japón [12]. En Colombia, a pesar del escaso registro, se han reportado
casos en Antioquia [24-6] y Amazonas [22]. Dada la alta distribución que presenta B.
cereus, su potencial patógeno y lo poco que se conoce en nuestro país, el objetivo de esta
revisión bibliográfica es presentar información actualizada sobre este microorganismo, se
incluyen aspectos relevantes sobre su biología, genética, toxinas y sus efectos en el humano,
y los alimentos susceptibles de contaminación por B. cereus.

14
 Bacillus cereus es un bacilo Gram positivo, anaerobio facultativo y móvil debido a la
presencia de flagelos perítricos [3-8]; forma esporas resistentes a condiciones adversas del
medio, como altas temperaturas, deshidratación y radiación, y produce diversas toxinas que
contaminan gran variedad de alimentos [7]. Es capaz de crecer en un amplio rango de
temperaturas, desde los 4 °C a 48 °C, a pHs de 4,9 a 9,3 y soporta concentraciones de NaCl
en el medio hasta del 7 % [3]. Las esporas son resistentes a bajas condiciones de humedad y
a tratamientos térmicos como la pasteurización o procesos de cocción de los alimentos [10]
y al ácido clorhídrico presente en el estómago, lo que constituye un peligro potencial para la
salud humana [4].

Bacillus cereus puede presentar diferentes grados de toxicidad de acuerdo a la cepa

[18]. Los alimentos más susceptibles de ser contaminados por cepas de B. cereus incluyen,
harinas, carnes, leches, quesos, verduras, pescados, arroz y sus derivados [8]. En general, se
ha evidenciado que B. cereus se encuentra frecuentemente contaminando alimentos con alto
contenido de almidón, debido a que B. cereus produce enzimas del tipo amilasas que le
permiten hidrolizar dicho carbohidrato y utilizarlo como fuente de carbono para su
crecimiento [10].

Se ha reportado la relación de algunos alimentos con determinados tipos de toxinas;

por ejemplo, el síndrome emético causado por la toxina emética se ha asociado
principalmente con el arroz frito y cocido, mientras que el síndrome diarreico causado por
las diferentes enterotoxinas se ha relacionado con carnes, vegetales y leche [12]. El motivo
de esta asociación parece ser el tipo de dieta que se acostumbra en los diferentes países, dado
que, en el hemisferio oriental, donde se presenta un consumo masivo de arroz y sus derivados,
se desarrolla con mayor frecuencia el síndrome emético; no obstante, se ha evidenciado que
las cepas de B. cereus aisladas de arroz producido en Corea son de tipo diarreico [13]; por lo
que sería importante realizar más estudios que evalúen la relación entre los tipos de alimentos
y las cepas toxigénicas de B. cereus en diferentes regiones. En la industria de alimentos es
de suma importancia mantener la inocuidad de los alimentos, de tal forma que no se excedan
los niveles establecidos de microorganismos patógenos, con el fin de no afectar la salud de
los consumidores; sin embargo, el control de Cereus se dificulta por el hecho de ser un

15
microorganismo esporulados con una gran capacidad para sobrevivir en diferentes ambientes
y en condiciones de estrés [14].

En la industria lechera, B. cereus puede constituir un serio problema debido a que

tanto la leche líquida como en polvo tienen un alto contenido de grasa, condición que
favorece la adhesión de las esporas, dificultando su eliminación [10], además puede formar
biopelículas en las tuberías de ordeño y equipamiento debido a los ácidos grasos que se
presentan durante la lipólisis grasa de la leche [20]. Adicionalmente, de acuerdo al tipo de
industria alimenticia se pueden establecer diferentes “nichos térmicos” para B. cereus, por lo
cual en plantas donde se trabajan con procesos térmicos como la deshidratación y
pasteurización se pueden encontrar cepas termo resistentes y en plantas donde emplean
cadenas de frío, prevalecen las cepas psicrófilos, haciendo difícil su eliminación [5].

Bacillus cereus puede ser aislado e identificado en muestras alimenticias en el medio

de cultivo MYP. La característica principal para la identificación de B. cereus en este medio
es la formación de un precipitado blanco, alrededor de las colonias que crecen de color rosa,
el cual corresponde al hidrólisis de lecitina en el medio por B. cereus. El rojo de fenol se
utiliza para detectar cambios de pH en el medio producto de la fermentación del manitol; las
colonias que crecen de coloración amarilla, resultado del descenso de pH del medio por la
fermentación del manitol, no corresponden a colonias de B. cereus, y la polimixina determina
la selectividad del medio puesto que inhibe a las bacterias Gram negativas [1]. Este medio
ha sido utilizado en diversos estudios para el aislamiento, enumeración y caracterización de
B. cereus en diferentes matrices como arroz [23].

En general, en el ámbito mundial, la detección y cuantificación de B. cereus en

alimentos por los laboratorios de control de calidad se realiza empleando pruebas de tipo
fenotípico y se llevan a cabo de acuerdo a las Normas Internacionales ISO 7932:2004 e ISO
21871:2006 [15]. Estas normas establecen realizar el recuento en placa utilizando agares
diferenciales para B. cereus como el agar Polimixina–Yema de huevo–Manitol (MYP) y el
agar Polimixina–Yema de huevo–Manitol– Azul de bromotimol (pemba), además de la
valoración de la producción de β–hemólisis en agar sangre de carnero [51]. En Colombia el

16
Instituto Nacional para la Vigilancia de Medicamentos y Alimentos (invima), implementó la
Norma Técnica Colombiana ntc: 4679 versión 1 de 2006, que es una adopción modificada
de la norma ISO 7932:2004, por la cual se determina el procedimiento para el análisis y la
cuantificación de colonias de B. cereus en alimentos para humanos y animales [11].

17
 METODOLOGÍA
Parte Experimental

1. Se pesaron asépticamente 10 gramos de muestra de condimento comercial y se agregaron al

agua peptonada homogenizando. Esto corresponde a la dilución 10−1 preparando así las
diluciones necesarias hasta 10−3
2. Se pipeteó 1 ml de la muestra o subdiluciones en placas de Petri por duplicado.
3. A las placas se les añadió de 15 a 20 ml de agar para recuento en placa (Agar Bacillus Cereus),
el cual fue fundido a 45 ºC.
4. El inoculo se mezcló con el agar mediante rotación de la placa de Petri.
5. Una vez solidificado el agar, se invirtieron las placas e incubaron a 35 ºC - 37 ºC durante 24
horas.
6. Se contaron las colonias que presentaron las siguientes características: colonias grandes,
secas, rugosas, de bordes irregulares, rodeadas de un halo de precipitado blanco denso, sobre
un fondo nítido de color rosado.
7. Se calculó el total de colonias por gramos o por mililitros de alimento, obteniendo así el
recuento presuntivo de Bacillus Cereus.

Confirmación y Recuento Presuntivo de B. Cereus:

1. Se seleccionan al azar el número de colonias típicas igual o aproximada a la

raíz cuadrada del número de ellas presentes en placas consideradas.
2. Características morfológicas: se prepara frotis a partir de las colonias
seleccionadas y se hace la coloración gram. Bacillus cereus es un bacilo corto de extremos
cuadrados, gram positivo, con esporas elipsoidales centrales o sub terminales no deformantes
y de paredes delgadas forman cadenas cortas o largas.
3. Se inoculan los siguientes medios de cultivos partir de las colonias
seleccionada para la realización de las pruebas bioquímicas siguientes

Caldo Nitrato:
a) Luego de inoculado se incuban los tubos a 30°C por 18 a 24 horas

18
 b) Se agregan los reactivos para la prueba de reacción de nitrito (0,1 ML) se
agitan los tubos y se observa el color, la aparición de un color rosado o rosa indica la
presencia de nitritos (prueba positiva). B. cereus reduce nitratos

Gelatina Nutritiva:
a) Se inoculan los tubos por punción, utilizando la aguja de platino y se incuban
a 30°C por 24 horas en posición vertical
b) Se registra la reacción B cereus la cual licúa ligeramente la gelatina
Caldo Glucosa Tamponado:

a) Se inoculan los tubos y se incuban a 30°C por 48 horas

b) Se investiga la presencia de acetil metil carbonil pipetrando 1 ML de cultivo
a un tubo vacío y agregando 0,6 ML de solución de Alfa naftol y 0,2 ML de KOH al 40%, se
agitan los tubos después de la adición de cada reactivo, unos cuantos cristales de creatina
añadidos al medio intensifican y acelera la reacción
c) La prueba se efectúa temperatura a ambiente y los resultados se leen horas
después
d) El desarrollo de una coloración rosa indica presencia de acetil metil carbonil.
El B cereus da reacción positiva para esta prueba

Caldo Glucosa Sin Fosfato:

a) Prueba de voges proskaver, detectar acetil metil carbinol, añadir reactivos y añadir
cristales de creatina para que la reacción sea más rápida

Movilidad:
a) Se siembra en Agar en un medio semisólido en picadura, si el microorganismo
es móvil crece por todo el medio
b) Se puede calcular el número más probable cuando se sospecha que el alimento
tenga menos de 10 UFC/ML. A partir de disoluciones decimales se siembran en: caldo
tripticasa a 31°C durante 48 horas, de los tubos en crecimiento se siembran en Mossel y se
confirma

19
 ESQUEMA

Condimento comercial

 P = Siembra por Profundidad

 Muestra de Arroz Cocido
 Agar Bacillus Cereus
 Incubar a 37ºC por 24/48 h

El agar selectivo para Bacillus cereus es un medio de cultivo que se utiliza para la
identificación y enumeración de Bacillus cereus en alimentos y muestras ambientales.

20
El agar selectivo más comúnmente utilizado para Bacillus cereus es el agar selectivo para
Bacillus cereus y Listeria (BACILLUS CEREUS SELECTIVE AGAR BASE), que contiene
los siguientes componentes:

Peptona: fuente de nitrógeno y aminoácidos para el crecimiento bacteriano.

Extracto de levadura: fuente de vitaminas y nutrientes para el crecimiento bacteriano.
D-manitol: un azúcar que permite diferenciar Bacillus cereus de otras bacterias.
Fosfato trisódico: ayuda a mantener el pH adecuado del medio.
Sulfato de magnesio: proporciona iones de magnesio esenciales para el crecimiento
bacteriano.
Bromocresol púrpura: un indicador de pH que cambia de color para detectar la
fermentación de D-manitol.
Agar: proporciona una superficie sólida para el crecimiento bacteriano.

Este agar selectivo favorece el crecimiento de Bacillus cereus y ayuda a inhibir el crecimiento
de otros microorganismos que pueden estar presentes en la muestra. La presencia de Bacillus
cereus se detecta por la aparición de colonias de color blanco-amarillento, con un halo de
precipitación oscuro alrededor de la colonia.

21
 OBSERVACIONES EXPERIMENTALES

Dilución Placa Colonias

10-1 1 Incontables
10-1 2 Incontables
10-2 1 55
10-2 2 21
10-3 1 19
10-3 2 30

Cálculos típicos
Formula
∑𝒄
𝑵=
𝑽 (𝒏𝟏 + 𝟎, 𝟏 ∗ 𝒏𝟐 )𝒅

𝟓𝟓 + 𝟐𝟏 + 𝟏𝟗 + 𝟑𝟎 𝟏𝟐𝟓
𝑵= = = 𝟓𝟔. 𝟖𝟏
𝟏(𝟐 + 𝟎, 𝟏 ∗ 𝟐) 𝟐, 𝟐

=5.681 × 101

22
 DISCUSIÓN DE RESULTADOS

Los condimentos comerciales son productos elaborados a base de especias, hierbas

aromáticas, verduras, frutas y otros ingredientes, que se utilizan para sazonar y realzar el
sabor de los alimentos uno de los patógenos más importante ligado a este producto es Bacillus
cereus

El condimento comercial se encuentra dentro del grupo denominado alimentos listos para el
consumo ya que no requieren tratamientos térmicos adicionales antes de ser ingeridos por el
consumidor. La calidad bacteriológica de este alimento depende de muchos factores
incluyendo la forma de conservarlo y la manipulación del mismo (Wogu et all., 2011).

El pH de los condimentos en polvo en general varía mucho, dependiendo de sus

ingredientes principales.
podemos clasificarlos en tres grupos principales:
1. Ácidos: Su pH oscila entre 2 y 4.
 Ejemplos: Vinagre en polvo, limón en polvo, cúrcuma en polvo, ácido cítrico en polvo,
pimentón ahumado en polvo.
2. Neutros:
 Su pH está alrededor de 7.
 Ejemplos: Sal en polvo, pimienta negra en polvo, ajo en polvo, cebolla en polvo, perejil en
polvo.
3. Alcalinos:
 Su pH se encuentra entre 8 y 10.
 Ejemplos: Bicarbonato de sodio en polvo, polvo de hornear, polvo de levadura.

El pH de un condimento en polvo puede cambiar con el tiempo, especialmente si se expone

a la humedad, calor o luz. El pH de un plato puede verse afectado por la combinación de los
condimentos en polvo utilizados. Algunos condimentos en polvo pueden contener
ingredientes ácidos o alcalinos adicionales que alteran su pH final
No obstante, la presencia de B. cereus en alimentos listos para el consumo generalmente se
ha relacionado con manejos inadecuados luego de la cocción (Martino et all., 2010).

Dicho todo esto, es importante mencionar que en la práctica realizada se lograron obtener los
resultados necesarios para el conteo de este microorganismo, esto pudo deberse a que los
condimentos a anlizar no están en condiciones inocuas para el consumo ya que presentan
gran crecimento de Bacillus cereus como fue en el caso de la muestra procesada (D. A.
McDowell et al. 2006).
La presencia de Bacillus cereus en condimentos comerciales plantea un desafío para la
industria alimentaria y los consumidores. Esta bacteria resistente, capaz de formar esporas
que sobreviven a condiciones adversas, puede contaminar los condimentos y provocar
intoxicación alimentaria.

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 CONCLUSIONES

Los objetivos planteados para el aislamiento e identificación de Bacillus Cereus pudieron

ser alcanzados en virtud del crecimiento de este microorganismo patógeno en las muestras
analizadas. La aplicación de la técnica de recuento en placas, seguida de la incubación y
observación de las colonias, reveló la presencia de Bacillus Cereus.

Es necesario considerar diversas posibilidades que podrían haber contribuido al gran

crecimiento, tales como posibles errores en la técnica de siembra, la calidad de las muestras
iniciales, condiciones ambientales inadecuadas, o la presencia de inhibidores en el medio de
cultivo. La revisión detallada de estos aspectos y la exploración de nuevas estrategias para la
detección de Bacillus Cereus son esenciales para mejorar la efectividad de futuras
investigaciones microbiológicas en muestras similares.

Bacillus cereus es un patógeno que se localiza de forma común en el suelo y, por tanto, en
cultivos como legumbres, cereales o especias. En condiciones secas, como las habituales en
alimentos como arroz o recipientes de especias, Bacillus cereus puede permanecer en forma
de esporas.

Cuando un alimento se somete a condiciones de cocción, las células de B. cereus con

frecuencia se destruyen, pero no las esporas, que son mucho más resistentes a temperaturas
de cocción y pueden permanecer en el alimento. Las esporas de B. cereus pueden sobrevivir
bien en el arroz seco y también tras la cocción.

En la microbiología de alimentos, el agar selectivo para Bacillus cereus es un medio de

cultivo útil para la detección y enumeración de la bacteria en alimentos y muestras
ambientales. La utilización de este medio selectivo permite la identificación específica de
Bacillus cereus, lo que facilita el análisis y control de calidad de los alimentos y ayuda a
prevenir intoxicaciones alimentarias causadas por esta bacteria.

Bacillus cereus es una bacteria patógena importante en la microbiología de alimentos que

puede causar intoxicaciones alimentarias graves. Es esencial prevenir la contaminación por
Bacillus cereus y utilizar métodos efectivos de detección y control de la bacteria en los
alimentos para garantizar la seguridad alimentaria.

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 RECOMENDACIONES

 Contar con la presencia de dos mecheros para la realización de la práctica sería de mucha
importancia y utilidad ya que es esencial para garantizar la pureza de los cultivos, la
esterilizacion de los instrumentos, evitar la contaminación y crear un ambiente de trabajo
seguro y aséptico, además de que permitirá agilizar la realización de la práctica.

 El agua es un recurso fundamental en un laboratorio de microbiología, contar con este recurso

es indispensable por varias razones, ya sea para la preparación de medios de cultivo y también
para la limpieza y desinfección del laboratorio e instrumentos.

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 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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